酱油制曲是酱油酿制过程的关键环节之一。成曲质量的好坏,不仅直接决定了氨基酸生成率和全氮的利用率,还影响到酱油中挥发性风味成分的形成。我国酱油行业普遍以沪酿3.042米曲霉为主要菌种制曲,此菌种具有生长快、产孢量大、酶系丰富、不产毒素等特点。但单菌种制曲与多菌种制曲相比,成曲酶系较为单一,不能充分的分解蛋白质及淀粉类原料,造成全氮利用率低,产品风味不足。针对上述单菌种制曲发酵的缺陷,本研究利用沪酿3.042米曲霉分别与沪酿3.350黑曲霉、沪酿3.972红曲霉及华根霉进行双菌种混合制曲,研究的主要内容和结论如下：1考察多菌种分别单独制曲对成曲酶活力的影响。以米曲霉、黑曲霉、红曲霉和华根霉为菌种,豆粕、麸皮为原料,33℃温度下分别制曲。结果表明：米曲霉42h成曲中性蛋白酶活力为3030u/g,酸性蛋白酶和糖化酶活性分别为457u/g.860u/g;黑曲霉48h成曲,中、酸性蛋白酶及糖化酶活力分别为48.3u/g.1222u/g和1576.61u/g；48h华根霉成曲中、酸性蛋白酶活力分别为1536.59u/g和679u/g,糖化酶活力为1084u/g；48h红曲霉成曲中、酸性蛋白酶及糖化酶活力分别为1272.59u/g.457.18u/g和589.91u/g。以上可知：米曲霉与黑曲霉混合制曲,可显著弥补米曲霉单独制曲时其酸性蛋白酶和糖化酶活力弱的缺陷。2混合制曲与单独制曲工艺的比较。米曲霉与黑曲霉3：1混合制曲,48h混合成曲中性、酸性蛋白酶及糖化酶活力分别达到了1865u/g、615u/g和950u/g；42h米曲霉成曲与48h黑曲霉成曲3：1混合,其混合成曲中性、酸性蛋白酶及糖化酶活力分别为2284u/g、648u/g和1046u/g。从结果知：两种菌种先分别单独制曲再混合成成曲,其混合曲样中各酶活力更佳。3利用电泳技术考察成曲中酶系的差异。用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取纯化成曲中胞外酶系,利用SDS-PAGE电泳获得成曲胞外酶谱,进而对酶系差异进行分析。研究发现：米曲霉成曲中,分子量大小在25kD、30kD、50kD处的酶系含量丰富；黑曲霉成曲中,20kD、45kD分子量的酶系含量丰富。判定最佳收曲时间时,电泳与测定酶活力两种方法确定的最佳收曲时间基本一致。对酱油行业常用的一日曲(28～32h)和二日曲(36～42h)的酶活力及酶系进行了对比分析,结果发现：两种测定方法都表明,二日曲酶活力更强、酶系更丰富、分泌的胞外蛋白含量更多。4混合制曲对酱油理化指标的影响。本研究考察了3种混合发酵工艺：(1)对照组米曲霉单独制曲发酵(2)米曲霉与黑曲霉成曲3：1混合发酵(3)后期添加8%的红曲米。结果显示：米曲霉单独制曲发酵工艺,氨基酸生成率和全氮利用率分别为40%、53%；与单独制曲工艺相比,米曲霉与黑曲霉混合工艺,其氨基酸生成率和全氮利用率分别提高了25%、15.28%；后期添加红曲米,氨基酸生成率和全氮利用率仅提高了5%和3.64%,但红色指数由5.04提高到了6.07。因此,混合制曲可有效提高原料利用率,红曲米的添加提高了酱油的红润度,增强了酱油的色泽。5成品酱油的GC/MS分析。用顶空固相微萃取法提取,以3-辛醇做内标,通过定性定量确定酱油中挥发性风味成分的种类和含量。结果表明：米曲霉单独制曲发酵共检出66种风味物质,第20天酱油中醇类、酚类及杂环类含量分别为1316.07ug/L、18.11ug/L和6.71ug/L；米、黑成曲以3：1混合发酵,共检出94种风味成分,发酵第25天酱油中醇类、酚类及杂环类含量分别达到了1529.07ug/L、21.09ug/L、7.39ug/L。特征性风味成分苯甲醛、苯乙醇含量分别提高了1.74ug/L、629.7ug/L;发酵后期添加红曲米,发酵共检出57种风味成分,第20天酱油中醇、酚及杂环类含量分别提高了92.43ug/L、12.03ug/L0.78ug/L,特征风味物质苯甲醛、苯乙醛分别由2.08ug/L、1.9ug/L提高到了4.77ug/L、3.54ug/L。以上数据显示混合制曲能够丰富酱油的风味成分,提高酱油特征性风味成分的含量。