在肝脏外科及肝脏移植手术中,肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI)是造成肝功能损害的重要因素,其损伤机制及脏器保护机理越来越受到人们的重视。内质网(endoplasmic reticulum, ER)是真核细胞中重要细胞器,主要参与蛋白质合成、修饰和折叠,类固醇、胆固醇和其它脂质生物合成和钙离子贮存,同时是细胞内其它膜性细胞器的重要来源,它在内膜系统中占有中心地位。但内质网非常敏感,缺血再灌注损伤会造成能量代谢障碍、细胞内自由基增多及内质网内钙超载,这些均可作为刺激因素导致内质网功能失调,即内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。近年来,葡萄糖调节蛋白(glucose regulated proteins, GRPs)在缺血再灌注损伤中所起的作用受到人们的关注。葡萄糖调节蛋白是一种内质网分子伴侣,是细胞为适应内质网应激状态所产生的一类应激蛋白。GRP78,又名免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein, Bip),在未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)信号传导通路中处于核心地位,被认为是内质网应激和未折叠蛋白反应起始的标志性分子。GRP94是内质网内数量最多的糖蛋白,可结合未折叠的多肽链,阻止蛋白质聚集,协助蛋白质折叠、伸展、组装和转运,抑制错误折叠蛋白质的分泌。丹参(radix salvia miltionrrhiza, RSM)是目前研究较多,效果较确切的活血化瘀类中草药之一,它可以防止HIRI时肝脏细胞内钙超载、减轻氧自由基及脂质过氧化损伤、保护细胞膜功能、阻断Fas和穿孔素的交叉作用,协同bcl-2基因表达,发挥细胞保护作用。既往认为丹参的保护作用机理与其改善微循环、抗氧自由基、以及钙阻滞作用有关,但尚未见报道过丹参的作用与葡萄糖调节蛋白的关系。本实验研究的主要目的旨在了解大鼠肝缺血再灌注期GRP78与GRP94的表达状况及作用意义,以及丹参预处理对大鼠肝缺血再灌注期GRP78与GRP94表达的影响,进一步认识丹参肝保护作用的分子机制,为应用丹参预处理防治肝缺血再灌注损伤提供依据。第一章大鼠肝缺血再灌注时葡萄糖调节蛋白78/94的表达及意义一、目的建立大鼠肝缺血再灌注损伤模型,动态观察肝缺血再灌注不同时限GRP78、 GRP94、磷酸化蛋白激酶B1(p-Akt1)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(cysteine-containing aspartate-specific proteases12, Caspase-12)的表达及作用意义。二、方法1.健康Wistar雄性大鼠55只随机分成3组：正常组(n=5)、假手术组(n=25)和缺血再灌注组(n=25),假手术组与缺血再灌注组又根据再灌注后不同时限(0h、3h、12h、24h、72h)分为5个亚组,每组n=5。2.术前禁食12h,自由饮水。腹腔麻醉生效后,常规备皮、消毒,正常组进腹后直接切取肝组织待测；假手术组仅解剖肝门；缺血再灌注组在肝十二指肠韧带远心端安置无损伤动脉钳钳夹肝蒂45min,于不同复流时间(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝组织。肝组织一半置入10%福尔马林固定,其余用无菌铝薄纸包装,放入液氮罐速冻,供检测使用。3.HE染色及免疫组织化学均按试剂盒内操作步骤进行,兔抗大鼠GRP78多克隆抗体、兔抗大鼠GRP94多克隆抗体及兔抗大鼠Caspase-12多克隆抗体的工作浓度为1：100,均购自Santa Cruz公司。4.光镜下进行病理组织学观察；免疫组织化学SABC法检测GRP78、GRP94及Caspase-12在肝脏不同缺血时限的表达量,采用Image pro-plus6.0软件分析系统进行定量检测。5.取出液氮罐存储的新鲜肝组织,用免疫蛋白印迹法检测p-Aktl表达量,具体操作步骤按说明书进行。兔抗大鼠p-Aktl多克隆抗体购自Santa Cruz公司6.所有数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,多组样本比较采用析因设计的方差分析(组间比较：方差齐采用LSD法,方差不齐采用Games-Howell法),以P<0.05为差异显著性判定标准。三、结果1.病理形态学观察结果：正常组与假手术组的肝小叶结构基本完整,肝细胞呈多面体形,胞核大而圆,居中。缺血再灌注组0h时可见肝细胞轻至中度水肿,肝窦间隙变窄；3h时肝细胞肿胀明显,胞浆疏松化,部分出现嗜酸样变；12h时弥漫性肝细胞肿胀,嗜酸样变；24h时损伤最重,可见肝小叶变形,部分出现片状坏死；72h时肝窦间隙狭窄减轻,肝小叶重构。2.GRP78的表达：阳性染色细胞呈棕黄色,位于胞质。正常组与假手术组表达较弱；缺血再灌注组GRP78的表达在各观察时限点明显高于以上两组(P<0.01),其表达趋势为：再灌注0-3h表达开始上升,12h时达峰值(P<0.01),24h仍处于相对高峰值,较正常组和假手术组高约一个数量级,较再灌注0h高约2倍,至再灌注72h,仍高于前述各组。3.GRP94的表达：组间比较相同观察时限点缺血再灌注组明显高于另外两组(P<0.01),表达趋势为：再灌注0～3h时表达明显增强,在12h时达峰值(P<0.01),24h表达仍处于相对高峰值(P<0.01),较正常组和假手术组高约一个数量级,相对高于再灌注0、3h；至再灌注72h,仍高于正常组和假手术组(P<0.01),与再灌注0h持平(P>0.05)。4. Caspase-12的表达：阳性染色细胞呈棕黄色,位于胞质。缺血再灌注各不同时限点Caspase-12表达明显高于正常组和假手术组(P<0.01),表达趋势为：再灌注0h时即有较高表达,3h时显著性高表达(P<0.01),于12h时达峰值(P<0.01),24h时表达虽有所降低,但仍远高于正常组与假手术组。再灌注72h时与0h持平,仍高于正常组和假手术组(P<0.01)。5. p-Aktl的表达：p-Aktl在正常组及假手术组的表达较弱,在缺血再灌注组的表达显著高于以上两组,于再灌注0h-3h表达上调,12h时达峰值,24-72h时仍处于较高水平。四、小结综上所述,大鼠肝缺血再灌注损伤可触发经内质网途经的Caspase级联反应活化：GRP78与GRP94可能通过降低内质网负荷和促进糖异生而发挥细胞保护作用,p-Aktl可能是此过程中机体通过PI3K/Akt信号通路上调GRP78表达的重要信号分子。第二章丹参预处理对大鼠肝缺血再灌注时葡萄糖调节蛋白78/94表达的影响一、目的建立大鼠肝缺血再灌注损伤模型,设立正常组、假手术组、缺血再灌注组及丹参预处理组,动态观察肝缺血再灌注不同时限GRP78、GRP9、p-Aktl及Caspase-12的表达特点,探讨丹参在肝缺血再灌注期对以上指标表达的影响及意义。二、方法1.健康Wistar雄性大鼠80只随机分成4组：正常组(n=5)、假手术组(n=25)、缺血再灌注组(n=25)和丹参预处理组(n=25),各实验组再按肝缺血45min后不同再灌注时限(0h、3h、12h、24h和72h)分为五个亚组,每个亚组n=5。2.术前禁食12h,自由饮水。腹腔麻醉生效后,常规备皮、消毒,正常组进腹后直接切取肝组织待测,假手术组仅解剖肝门；缺血再灌注组在肝十二指肠韧带远心端安置无损伤动脉钳钳夹肝蒂45min,于不同复流时间(0h、3h、12h、24h、72h)切取肝组织。丹参预处理组：丹参注射液(0.6g/kg)加生理盐水至40ml/kg,术前尾静脉推入,麻醉及手术方法同缺血再灌注组。肝组织一半置入10%福尔马林固定,其余用无菌铝薄纸包装,放入液氮罐速冻,供检测使用。3.HE染色及免疫组织化学均按试剂盒内操作步骤进行,兔抗大鼠GRP78多克隆抗体、兔抗大鼠GRP94多克隆抗体及兔抗大鼠Caspase-12多克隆抗体的工作浓度为1：100,均购自Santa Cruz公司。4.光镜下进行病理组织学观察,免疫组织化学SABC法检测GRP78、GRP94及Caspase-12在肝脏不同缺血时限的表达量,采用Image pro-plus6.0软件分析系统进行定量检测。5.取出液氮罐存储的新鲜肝组织,用免疫蛋白印迹法(Western-blot)检测p-Akt1表达量,具体操作步骤按说明书进行。兔抗大鼠p-Akt1多克隆抗体购自Santa Cruz公司。6.所有数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,多组样本比较采用析因设计的方差分析(组间比较：方差齐采用LSD法,方差不齐采用Games-Howell法),以P<0.05为差异显著性判定标准。三、结果1.病理形态学观察结果：正常组与假手术组的肝小叶结构基本完整,肝细胞呈多面体形,胞核大而圆,居中。缺血再灌注组0h时可见肝细胞轻至中度水肿,肝窦间隙变窄；3h时肝细胞肿胀明显,胞浆疏松化,部分出现嗜酸样变；12h时弥漫性肝细胞肿胀,嗜酸样变；24h时损伤最重,可见肝小叶变形,部分出现片状坏死；72h时肝窦间隙狭窄减轻,肝小叶重构。相同时限点丹参组损伤程度较缺血再灌注组轻。2.GRP78的表达：阳性染色细胞呈棕黄色,位于胞浆。正常组与假手术组表达较弱；在相应时限点,GRP78在缺血再灌注组的表达明显高于假手术组(P<0.01)；GRP78在缺血再灌注0h时表达开始上升,在12h时达峰值(P<0.01),24h表达仍处于相对高峰值,较正常组和假手术组高约一个数量级,较再灌注0h高约2倍,至再灌注72h,仍高于前述两组表达水平。在丹参预处理组,相应再灌注时限点GRP78的表达均弱于缺血再灌注组(P<0.01)。3.GRP94的表达：阳性染色细胞呈棕黄色,位于胞浆。正常组与假手术组表达较弱；在相应时限点,GRP94在缺血再灌注组的表达明显高于假手术组(P<0.01),表达趋势为：再灌注0-3h时表达明显增强,在12h时达峰值(P<0.01),24h表达仍处于相对高峰值(P<0.01),较正常组和假手术组高约一个数量级,相对高于再灌注0、3h；至再灌注72h,仍高于正常组和假手术组(P<0.01),与再灌注0h持平(P>0.05)。在丹参预处理组,相应再灌注时限点GRP94的表达均弱于缺血再灌注组(P<0.01)。4. Caspase-12的表达：阳性染色细胞呈棕黄色,位于胞浆。Caspase-12在正常组与假手术组表达较弱；在缺血再灌注组0h-3h时即有较高表达,于12h时达峰值(P<0.01),24h-72h时表达有所降低,但仍远高于正常组与假手术组。在丹参预处理组,相应再灌注时限点Caspase-12的表达均弱于缺血再灌注组(P<0.01)。5. p-Akt1在正常组及假手术组两组的表达较弱,在缺血再灌注组的表达显著高于以上两组,于再灌注0h时开始表达,12h时达峰值,24h-72h时仍处于较高水平。p-Aktl在丹参预处理组的表达均强于缺血再灌注组。四、小结大鼠肝缺血再灌注时,丹参可能通过增强p-Akt1的表达、促使GRP78及GRP94适量表达,进而降低内质网负荷,发挥细胞保护作用。