根瘤菌-豆科植物共生固氮体系是自然界中固氮效率最高的固氮系统。刺槐（Robinia pseudoacacia）作为一种生长迅速、抗逆性强且固氮能力突出的豆科乔木,在水土保持、防风固沙、土壤修复等方面具有重要作用,是黄土高原地区人工造林等生态恢复战略的重要先锋树种。开展根瘤菌-刺槐共生固氮体系相关研究既有助于发挥刺槐的生态价值,也可加深对共生固氮机理的了解。Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123（GS0123）菌株由本实验室自刺槐根瘤中分离,可与刺槐特异性结瘤。三型分泌系统（type 3 secretion system,T3SS）是革兰氏阴性病原菌分泌毒力蛋白的工具,在病原菌对宿主的侵染中发挥重要作用。根瘤菌亦可通过T3SS分泌效应因子到宿主细胞内,进而调控根瘤菌与豆科植物共生关系的建立,前期工作已证明GS0123-刺槐共生固氮体系的建立需要α-Rhc I家族T3SS-I的参与。本研究即以GS0123-刺槐共生固氮体系为研究对象,首先通过序列比对分析和分泌实验鉴定出GS0123菌株的两个三型分泌系统效应因子（type 3 secretion system effectors,T3Es）NopP和GS6880。随后利用同源重组技术构建了nopP基因缺失突变体（△nopP）、GS6880基因缺失突变体（△GS6880）和相应回补菌株,并进行了植物回接实验;在侵染前期,分别测定接种野生型根瘤菌和突变体根瘤菌的刺槐共生相关生理指标,并以刺槐根为样品进行了转录组学和磷酸蛋白组学分析。在侵染后期,统计结瘤情况和植物生长情况,并利用石蜡切片观察根瘤内部显微结构,透射电子显微镜观察根瘤固氮区类菌体形态。最后分别以两个效应蛋白为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛库实验筛选其在宿主植物中的靶标蛋白,并进一步通过酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀实验验证蛋白互作结果,同时利用荧光蛋白标记对效应因子及其靶标进行亚细胞定位。研究结果如下:（1）nopP和GS6880基因位于根瘤菌GS0123共生质粒T3SS基因簇中,在植物共生信号类黄酮的诱导下,基因表达水平上调。分泌实验表明这两个基因所编码的蛋白是T3SS-I的效应因子。qRT-PCR实验结果表明,这两个基因在侵染前期表达量显著上调,表明二者主要在侵染前期发挥作用。（2）△nopP菌株接种刺槐后,在侵染前期引发刺槐根中活性氧含量、果胶酯酶及果胶裂解酶酶活瞬时下降,植物防御相关基因瞬时下调;刺槐根瘤固氮酶活和叶片叶绿素含量略有下降,根瘤内部显微结构以及固氮区类菌体形态未观察到明显差异。这些结果表明,NopP可能在侵染前期瞬时激活植物防御,但对GS0123菌株的侵染能力及与刺槐的共生效率影响较小。此外,在酵母双杂交文库中筛选到NopP在刺槐中的靶标蛋白Trafficking protein particle complex subunit 13-like protein（TRAPPC13）,二者均定位于细胞膜上。（3）△GS6880菌株接种刺槐后,在侵染前期引发刺槐根中活性氧含量升高,防御相关激素水杨酸以及茉莉酸含量升高,部分防御相关基因表达量上调,一些防御相关蛋白磷酸化水平升高。在烟草叶片中,GS6880可抑制由INF1诱导的细胞死亡,但对由Bax诱导的细胞死亡无抑制作用。与接种野生型根瘤菌的刺槐相比,接种△GS6880突变体菌株的刺槐叶片叶绿素含量下降,所结根瘤数目略有增加,同时根瘤体积减小,根瘤干重和固氮酶活显著下降;根瘤内部显微结构和固氮区类菌体形态无明显差异。这些结果表明GS6880参与抑制侵染前期宿主刺槐的防御反应。（4）经筛选鉴定,CDPK-related kinase 3（CRK3）是GS6880在刺槐中的靶标蛋白,GS6880与CRK3蛋白C端相互作用。GS6880定位于细胞核和细胞膜上,CRK3定位于细胞核、细胞膜和叶绿体上,二者可共定位于细胞核与细胞膜。根据转录组及磷酸蛋白组数据分析,在接种△GS6880的刺槐根中鉴定到15个表达水平发生显著变化的共生固氮相关基因,4个蛋白磷酸化修饰水平显著上调的共生固氮相关蛋白。综上所述,NopP和GS6880作为根瘤菌GS0123的T3Es,在刺槐细胞内分别与TRAPPC13和CRK3相互作用,并在GS0123-刺槐结瘤共生体系建立早期发挥作用,其中NopP可瞬时激活刺槐免疫,GS6880参与抑制刺槐免疫。