【摘 要】
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目的探讨人源重组蛋白颗粒蛋白前体rhPGRN(recombinant human progranulin,rhPGRN)对软骨细胞C28I2和巨噬细胞RAW264.7增殖、自噬和内质网应激的影响及作用机制。方法采用Ni-
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目的探讨人源重组蛋白颗粒蛋白前体rhPGRN(recombinant human progranulin,rhPGRN)对软骨细胞C28I2和巨噬细胞RAW264.7增殖、自噬和内质网应激的影响及作用机制。方法采用Ni-NTA琼脂糖树脂对组氨酸标签蛋白进行特异性亲和纯化,通过考马斯亮蓝染色、BCA法和Western blot验证目的蛋白的纯度和浓度。将细胞随机分为对照、rhPGRN、U0126、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、rhPGRN+U0126、rhPGRN+3-MA、rhPGRN+bafilomycin A1(Baf-A1)、rhPGRN+4-苯基丁酸钠(4-phenyl butyric acid,4-PBA)组,采用细胞计数法、Western blot和RT-PCR检测rhPGRN对C28I2和RAW264.7两种不同类型细胞增殖、自噬和内质网应激(ER stress)的影响。结果(1)在含有His标签PGRN的稳转细胞株中成功提取高纯度、具有生物活性的人源重组蛋白rhPGRN。(2)rhPGRN能促进C28I2和RAW264.7细胞的增殖,促进细胞周期相关基因PCNA、Cyclin B1(CCNB1)和Cyclin D1(CCND1)mRNA的表达,上调细胞周期调控蛋白Ki67表达,并激活增殖相关信号分子ERK和Akt蛋白的磷酸化表达水平。(3)ERK通路抑制剂U0126抑制了rhPGRN诱导的细胞增殖、自噬和内质网应激;使用3-MA抑制PI3K/Akt通路后,rhPGRN诱导的细胞自噬被显著抑制;自噬抑制剂Baf-A1和内质网应激抑制剂4-PBA显著下调了rhPGRN诱导的Ki67蛋白表达增加。结论rhPGRN通过MAPK、PI3K/Akt通路调控自噬和内质网应激,进而促进C28I2和RAW264.7细胞增殖。
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