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研究背景PH（pulmonary hypertension,肺高血压）一种严重的致死性疾病,主要表现为肺小血管重构、肺血管阻力增加和继发性右心衰竭。大量文献表明PASMCs（pulmonary arterial smooth muscle cells,肺动脉平滑肌细胞）的过度增殖和迁移是PH发生发展的重要病理因素。ZIP12是锌转运蛋白家族的一员,可将细胞外锌离子转运至细胞内。最新的研究发现,ZIP12的表达上调与缺氧诱导的细胞内游离锌离子的升高和PASMCs的过度增殖有关。ZIP12基因敲除可抑制缺氧诱导的细胞外锌离子内流及细胞增殖,改善肺血管重构,抑制肺动脉压力的升高。然而,ZIP12 在 MCT（monocrotaline,野百合碱）诱导的 PAH（pulmonary arterial hypertension,肺动脉高压）大鼠中的表达及其作用机制仍不明确。目的本研究的目的是观察ZIP12在MCT诱导的PAH大鼠肺组织中的表达,并研究其在PASMCs增殖和迁移中的作用及可能机制。方法第一部分ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中的表达根据团队前期制定的方案,采用间隔一周分2次腹腔注射20mg/kg的MCT建立PAH大鼠模型。在MCT给药4周后,检测血流动力学指标、RVHI（right ventricular hypertrophy index,右心室肥厚指数）和肺及右心组织形态学改变。采用免疫荧光和免疫组化染色检测肺组织中ZIP12的表达及定位情况。RT-qPCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,实时荧光定量 PCR）检测肺组织中ZIP12mRNA的表达情况。Western blot检测肺组织中ZIP12、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、PCNA 和 cyclin D1 的蛋白质表达情况。第二部分ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移中的作用从MCT诱导的PAH大鼠和对照组大鼠肺动脉分离并培养PASMCs。通过形态学和α-SMA免疫荧光染色对细胞进行鉴定。使用ZIP12单克隆抗体和细胞膜标记探针DiO对PASMCs进行染色,确定细胞内ZIP12的表达定位。构建ZIP12敲除和过表达慢病毒,分别转染PAH-PASMCs和Ctrl-PASMCs。采用EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）掺入法检测细胞增殖。划痕实验检测细胞迁移能力。Western blot检测ZIP12、PCNA和cyclin D1的蛋白质表达水平。第三部分ZIP12参与野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的机制探索为了进一步探讨ZIP12调控细胞增殖和迁移的分子机制,首先通过Western blot检测10%FBS（fetalbovine serum,胎牛血清）刺激的 Ctrl-PASMCs 和 PAH-PASMCs中AKT和ERK1/2的磷酸化。将ZIP12基因敲除和过表达慢病毒分别转染PAH-PASMCs和Ctrl-PASMCs,检测ZIP12沉默和过表达对AKT和ERK1/2磷酸化的影响。之后分别使用PI3K/AKT通路抑制剂（LY294002,10μM）和ERK通路抑制剂（U0126,10μM）对ZIP12过表达的PASMCs进行预处理。采用EdU掺入法检测细胞增殖。划痕实验检测细胞迁移能力。Western blot检测p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、PCNA 和 cyclin D1 的蛋白质表达水平。结果第一部分ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中的表达MCT 给药 4 周后,mPAP（mean pulmonary arterial pressure,平均肺动脉压）、RVHI、WA%（percentwall area,血管壁面积百分比）、WT%（percent wall thickness,血管壁厚度百分比）和远端动脉肌化程度与对照组相比显著升高（mPAP:Ctrl 19.07±2.53mmHg,PAH31.18±2.67mmHg,P<0.05;RVHI:Ctrl25.60±4.78%,PAH 50.55±6.77%,P<0.05;WA%:Ctrl61.93±5.03,PAH 94.08±2.49,P<0.05;WT%:Ctrl 23.15±5.80,PAH 72.05±6.96,P<0.05;非肌化血管:Ctrl 66.57±10.39%,PAH 18.38±9.04%,P<0.05;部分肌化血管:Ctrl 20.18±7.45%,PAH 31.05±7.34%,P<0.05;完全肌化血管:Ctrl 13.25±7.17%,PAH 50.57±12.53,P<0.05）,并且PCNA阳性细胞数和血管周围胶原沉积较对照组均明显增多。右心室HE染色结果显示,MCT诱导的PAH组心肌细胞横截面积较正常对照组相比显著增加（心肌细胞横截面积:Ctrl 174±31.44μm2,PAH 443.88±69.89μm2,P<0.05）。RT-qPCR和Westernblot结果显示,在MCT诱导的PAH大鼠肺组织中ZIP12mRNA和蛋白质表达水平较对照组相比均显著升高（P<0.05）。免疫荧光和免疫组化染色结果显示,ZIP12在MCT诱导的PAH大鼠肺动脉平滑肌层的表达明显增强。此外,与对照组相比,MCT诱导的PAH大鼠肺组织中p-AKT、p-ERK1/2、PCNA和cyclin D1的蛋白表达水平显著增加（P<0.05）,而AKT和ERK1/2的表达无显著差异（P>0.05）。第二部分ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移中的作用分离培养的PASMCs呈长梭形,边界清晰,经α-SMA免疫荧光染色证实分离培养的细胞为平滑肌细胞。细胞免疫荧光染色显示ZIP12分布于细胞膜上。与Ctrl-PASMCs相比,PAH-PASMCs的增殖和迁移率显着增加（细胞增殖率:Ctrl-PASMCs 11.06±1.32%,PAH-PASMCs25.23±3.62%,P<0.05;细胞迁移率:24h:Ctrl-PASMCs 21.24±2.90%,PAH-PASMCs 46.74±6.93%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 39.01±6.74%,PAH-PASMCs 77.93±11.76%,P<0.05）。通过 Western blot检测PCNA和cyclin D1的表达证实了上述结果（P<0.05）。这些作用可通过沉默 ZIP12 而得到显著抑制（细胞增殖率:Ctrl-PASMCs 12.11±1.62%,PAH-PASMCs 21.53±2.47%,PAH-PASMCs+LV-shNC 19.93±4.56%,PAH-PASMCs+LV-shZIP 1214.14±1.85%,P<0.05;细胞迁移率:24h:Ctrl-PASMCs 23.02±3.62%,PAH-PASMCs 43.36±4.87%,PAH-PASMCs+LV-shNC 42.20±6.71%,PAH-PASMCs+LV-shZIP12 29.95±2.41%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 40.89±3.60%,PAH-PASMCs 82.34±7.06%,PAH-PASMCs+LV-shNC 76.46±5.60%,PAH-PASMCs+LV-shZIP1250.23±5.55%,P<0.05）。相反,过表达ZIP12能够促进细胞的增殖和迁移（细胞增殖率:Ctrl-PASMCs 12.46±1.23%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 10.90±1.61%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12 18.03±0.77%,P<0.05;细胞迁移率:24h:Ctrl-PASMCs 26.11±3.39%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 20.92±8.79%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP1260.28±9.81%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 44.58±3.80%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 37.67±10.65%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12 77.03±10.06%,P<0.05）,上调 PCNA和 cyclin D1 的表达（P<0.05）。第三部分ZIP12参与野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的机制探索Westernblot 结果显示,10%FBS 刺激 PAH-PASMCs 诱导的 AKT 和 ERK1/2的磷酸化程度明显高于Ctrl-PASMCs（P<0.05）。在PAH-PASMCs中沉默ZIP12显著抑制AKT和ERK1/2的磷酸化（P<0.05）,然而在Ctrl-PASMCs中过表达ZIP12显著促进AKT和ERK1/2的磷酸化（P<0.05）。使用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理ZIP12过表达的Ctrl-PASMCs能够部分抑制ERK1/2磷酸化的增加,而ERK通路抑制剂U0126对AKT的磷酸化没有影响,表明AKT位于ERK1/2的上游。此外,LY294002能够完全抑制ZIP12过表达对细胞增殖和迁移的促进作用,而U0126仅表现出部分抑制的作用（细胞增殖率:Ctrl-PASMCs 11.49±1.05%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 11.32±1.36%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP1219.85±0.60%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+LY294002 4.81±1.30%,Ctr1-PASMCs+LV-ZIP12+U0126 15.31±0.39%,P<0.05;细胞迁移率:24h:Ctrl-PASMCs 30.29±3.22%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 20.94±6.01%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP1257.48±8.76%,Ctrl-PASMCs±LV-ZIP12+LY294002 24.53±3.31%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+U0126 44.53±7.03%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 41.92±8.98%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 36.06±9.18%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12 78.99±5.73%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+LY294002 36.74±2.15%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+U012660.91±8.04%,P<0.05）。结论1.ZIP12在MCT诱导的PAH大鼠肺组织中表达升高;2.ZIP12参与了MCT诱导的PAH大鼠PASMCs的过度增殖和迁移;3.ZIP12可通过AKT/ERK通路调控PASMCs的增殖和迁移。