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目的耐药性是导致肿瘤治疗失败的主要原因,其中的机制仍有待研究。本研究的目的是探讨miRNAs(microRNA,微小RNA)的表达水平与石蜡包埋乳腺癌组织化疗耐药性及预后的关系,从而进一步提供有效的治疗靶向分子。方法1、采用miRNAs微阵列分析筛选耐药相关miRNAs,并用RT-qPCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,实时荧光定量聚合酶链式反应)进行验证。2、在南京鼓楼医院和江苏省肿瘤医院回顾性检索2010年1月至2015年2月接受新辅助化疗的乳腺癌病例55例,获得81个符合研究标准的乳腺癌FFPE(formalin-fixed paraffin-embedded,福尔马林固定石蜡包埋)组织。分别比较自身配对的26对FFPE中miRNAs表达水平以及新辅助化疗后有效组与无效组中miRNAs表达水平。3、分别转染miR-4443模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitors)干预细胞,应用MTT法和流式分析细胞仪检测miR-4443对耐药性的影响。4、通过TargetScan软件预测miR-4443的特异靶基因,采用RT-qPCR法检测细胞中 TIMP2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2,金属蛋白酶组织抑制物 2)mRNA(messenger RNA,信使 RNA)的表达。5、利用TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌症数据库)数据库绘制Kaplan Meier生存曲线,验证TIMP2表达水平与患者生存时间之间的相关性。结果1、结合miRNAs芯片结果和前期的耐药性研究结果,共挑选28个miRNAs进行细胞株的RT-qPCR验证,所得结果与芯片结果一致(miR-671除外)。2、比较自身配对的26对FFPE中miRNAs的表达水平发现:10个miRNAs在新辅助化疗后标本中的表达水平显著高于新辅助化疗前。检测新辅助化疗后标本中miRNAs的表达水平,结果提示:8个miRNAs在无效组中的表达水平显著高于有效组。3、MiR-4443 在 MDA-MB-231/Epi 细胞中的表达是 MDA-MB-231/S 细胞的 2.83倍。与阴性对照相比,MDA-MB-231/S细胞转染miR-4443模拟物后,miR-4443的表达明显增加,转染后细胞的IC50(half maximal inhibitory concentration,半数致死浓度)也显著增加,而表阿霉素诱导的细胞凋亡显著减少;将miR-4443的抑制剂转染至MDA-MB-231/Epi细胞后,miR-4443的表达明显下调,转染细胞的IC50也明显降低,而表阿霉素诱导的细胞凋亡显著增加。4、TargetScan软件确定了 TIMP2的3’ UTR序列上与miR-4443互补的3个结合位点。检测分析结果显示:与阴性对照细胞相比,转染模拟物的MDA-MB-231/S细胞中TIMP2信使RNA的表达水平明显降低,而转染抑制剂的MDA-MB-231/Epi细胞中TIMP2信使RNA的表达水平显著升高。5、利用TCGA数据库绘制Kaplan Meier生存曲线,结果表明TIMP2低表达的患者预后较差。结论1、MiRNAs参与了乳腺癌细胞的耐药性调节机制。2、MiR-29a、miR-34a、miR-140、miR-222、miR-423、miR-574、miR-744、miR-3178、miR-4443、miR-6780b与乳腺癌化疗药物的耐药性呈正相关,miR-29a、miR-140、miR-222、miR-574、miR-744、miR-4443、miR-6780b、miR-7107与乳腺癌化疗疗效呈负相关。3、MiR-4443在乳腺癌耐药细胞中的表达显著高于敏感细胞。体外转染miR-4443模拟物和抑制剂后发现miR-4443的表达水平与乳腺癌细胞对表阿霉素的耐药性呈正相关。4、生物信息学分析提示TIMP2是miR-4443的特异性靶基因之一,其表达水平受miR-4443的负向调控。5、TIMP2的低表达与乳腺癌患者的不良预后呈正相关。