大鼠骨癌痛外周机制的研究：溶血磷脂酸调制TRPV1电流及其信号通路分析癌症(cancer),医学术语亦称恶性肿瘤(malignant neoplasm),它是由控制细胞生长增殖的机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外,还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分,骨是最常见的转移灶之一。骨癌伴随的疼痛严重影响病人的生活质量。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是一类具有生物活性的结构简单的甘油磷脂类物质,它普遍存在于所有真核生物的各种组织内,具有广泛的生物学功能,包括细胞增殖、迁移、心血管功能、伤口愈合、细胞粘连以及调节细胞因子的释放等。目前发现LPA有五类受体,LPA1-5,它们均为G蛋白偶联受体,在外周感觉传入初级神经元背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)细胞上主要表达LPA1受体。近年来的许多报道表明,LPA参与肿瘤细胞的增殖和转移,以及神经病理痛的产生。然而,尚不清楚LPA是否也参与癌症痛的产生。辣椒素受体(TRPV1)是一类非选择性阳离子通道,能被辣椒素、伤害性热刺激、酸以及多种内源性配体所激活而产生内向电流。TRPV1是特异表达在伤害性感受器上传递疼痛信息的一类重要的信号分子,近年来的研究表明它在骨癌痛中发挥着重要的作用。TRPV1受体可以被许多炎症介质如缓激肽、趋化因子和P物质等所调制。本论文在大鼠胫骨骨髓腔内接种WALKER 256乳腺癌细胞的骨癌痛模型上,应用X光检测、透射电镜、免疫荧光组织化学、蛋白免疫印迹、全细胞膜片钳以及行为学等实验技术,研究了骨癌动物外周形态学和行为学的变化、LPA在骨癌痛形成中的作用、LPA对TRPV1受体的调制及其可能的信号通路。主要结果如下：1.骨癌痛模型：行为学和形态学变化1.1.大鼠骨癌痛模型的建立大鼠胫骨骨髓腔内接种WALKER 256乳腺癌细胞后,出现了类似临床的病理特征如机械痛敏、骨质损伤和体重下降等系列的行为和形态学的变化。在肿瘤接种后的第15天,x光检测发现骨癌大鼠术侧胫骨发生了严重的骨质损伤,骨内局部结构缺失,边缘模糊,骨内密度不均匀,关节边缘的骨质被明显地侵蚀和破坏。在此阶段,骨癌动物状态较差,体形瘦弱,摄食减少,反应迟钝,毛色暗沉,患侧腿很少负重,轻触即可引起疼痛。接种16天以后骨癌大鼠状态逐渐变差,并开始陆续死亡。利用von Frey探针测试对骨癌痛的发展时程进行了检测。和假手术动物相比,骨癌动物在接种后的第7天,其机械缩腿反射阈值(paw withdrawl threshold,PWT)有明显的降低,即出现了机械触诱发痛(allodynia),之后其PWT值持续降低,接种后第16天降到最低。之后可能由于骨癌的发展导致骨癌大鼠行动能力受到影响而使PWT值有了回升。1.2.骨癌引起的大鼠外周神经系统的变化通过透射电镜和免疫荧光组织化学染色技术观察了骨癌大鼠外周神经系统的变化。后关节囊神经是胫神经的一个分支,它支配着胫骨骨髓腔。对接种后第14天的骨癌动物和假手术动物的后关节囊神经进行了透射电镜观察。结果显示,和假手术动物后关节囊神经形状规则、结构完整的髓鞘相比,骨癌动物的后关节囊神经有明显的脱髓鞘现象,部分神经的髓鞘结构已经被完全破坏,表明骨癌动物中支配骨髓腔的神经纤维受到了明显的损伤。激活转录因子3(activating transcription factor 3, ATF3)是激活转录因子／cAMP反应元件结合蛋白(activating transcription factor/cAMP-responsive element binding protein, ATF/CREB)家族的成员之一,通常被用来作为神经损伤的神经元标记物。采用免疫荧光组织化学观察了接种后第14天骨癌动物和假手术动物双侧腰4-6 (lumber 4-6, L4-6)节段的DRG中ATF3的表达。结果显示,骨癌动物术侧L4、5节段DRG中ATF3的表达明显上调,并且和大细胞标记物神经微丝蛋白200 (neurofilament 200, NF200)以及肽能小细胞标记物降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)均存在大量的共标,而与非肽能小细胞标记物异凝集素B4 (griffonia simplicifolia isolectin B4, IB4)几乎不存在共标。表明骨癌动物术侧腰4-5节段DRG中大细胞和肽能小细胞存在大量损伤,而非肽能小细胞则几乎没有损伤。2.LPA对骨癌大鼠外周伤害性感受器的作用2.1.LPA1受体表达的上调及其拮抗剂对骨癌痛的抑制为了研究LPA在骨癌痛中可能发挥的作用,检测了接种后第14天骨癌动物术侧DRG L4-6节段中LPA1受体表达的变化。蛋白免疫印迹法(western blot)结果表明,和假手术动物相比,接种后第14天骨癌动物术侧DRG L4-6中LPA1受体表达明显上调,提示LPA及其受体LPA1可能参与了骨癌痛的产生。因此,进一步利用LPA1拮抗剂VPC32183研究了LPA1的激活在骨癌痛中的作用。分别在接种前和接种后第2、4、7和9天,通过腰穿给药(lumber puncture, i.p.)的方式对骨癌动物鞘内给予VPC32183或生理盐水,作为给药组和对照组。结果表明,和对骨癌动物给予生理盐水相比,鞘内给予VPC32183可以部分翻转骨癌动物机械触诱发痛和热痛敏的形成,表明LPA1的激活参与了骨癌痛的产生。2.2.LPA对TRPV1通道活动的增强基于TRPVl受体是伤害性感受器的重要信号分子,为此检测了骨癌动物DRG中TRPV1受体的变化。利用western blot和急性分离的DRG神经元的全细胞膜片钳等实验技术分别检测了接种后第14-16天骨癌动物术侧DRG中TRPV1受体表达量的变化以及TRPV1电流幅度的变化。结果表明,和假手术动物相比,接种后第14-16天骨癌动物术侧DRG中TRPV1受体的表达明显上调。为了降低TRPV1受体对辣椒素的脱敏作用,采用较低浓度(0.5μM)的辣椒素来诱导产生TRPV1电流。将接种后第14-16天的骨癌动物和假手术动物术侧L4-6的DRG神经元上由0.5μM辣椒素引起的TRPV1电流幅度度进行了比较。由于细胞的个体差异,每个细胞对0.5μM辣椒素引起的电流幅度差异很大,因此,将所有细胞按照其电流幅度的不同分成两组,电流幅度低于100 pA的为低电流组,电流幅度高于100 pA的为高电流组。结果表明,和假手术动物相比,骨癌动物中低电流组和高电流组电流的平均幅度均有显著上调。2.3.LPA对TRPV1电流调制的胞内信号通路利用免疫荧光双标技术检测了LPA1受体和TRPV1受体在DRG神经元上的共表达。结果显示,LPA1受体和TRPV1受体在DRG神经元上存在大量的共表达,这为它们之间可能的相互作用提供了形态学基础。急性分离的DRG神经元的全细胞膜片钳记录了LPA对TRPV1电流的调制作用。结果表明,LPA可以增强0.5μM辣椒素引起的TRPV1电流,这种增强作用呈时间依赖性。在给予LPA一分钟后,TRPV1电流开始增大,直到给药后的第3分钟,电流增到最大,之后电流慢慢减小,第9分钟回到基础水平。同时,LPA对TRPV1电流的调制作用也呈剂量依赖性,分别给予1μM,0.1μM或0.01μM LPA一分钟后,辣椒素电流分别增加了221±37%,109±19%和58±9%,而0.001μM LPA对TRPV1电流没有明显的增强。与正常动物相比,在骨癌动物中,LPA对TRPV1电流的调制作用更明显。在假手术动物中,极低浓度的辣椒素(0.5 nM)不能诱发内向电流,而40%的骨癌动物的背根神经节神经元对0.5 nM的辣椒素有反应。对0.5 nM的辣椒素无反应的骨癌动物DRG神经元中,0.01μM LPA可以诱导0.5 nM的辣椒素产生一个内向电流,然而,这种现象在假手术动物中并没有发现,表明LPA在骨癌状态下能易化辣椒素电流。进一步研究了LPA调制TRPV1可能的信号通路。在给予LPA之前,将细胞分别给予LPA1受体拮抗剂.VPC32183、蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)拮抗剂BIM. PKCε拮抗剂εV1-2、蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)拮抗剂H89以及小G蛋白Rho抑制剂BoTXC3,结果发现VPC32183、BIM以及εV1-2均可以阻断LPA对TRPV1电流的增强,而H89和BoTXC3不能影响LPA对TRPV1电流的易化作用。该结果表明,LPA对TRPV1受体的调制作用是通过其受体LPA1来完成的,并依赖于其下游PKC信号通路,尤其是PKCε亚型的激活,而PKA和Rho-Rock通路并不参与此过程。结论：(1)骨癌引起大鼠外周神经的损伤和持续性疼痛；(2)骨癌明显上调伤害性感受器DRG中LPA1受体的表达,其拮抗剂减弱骨癌痛的形成；(3)LPA1受体的激活能增强DRG神经元中的TRPV1电流,这种增强作用可能是LPA参与骨癌痛的外周机制之一；(4)LPA对TRPV1受体的调制作用主要依赖于PKC信号通路,尤其是PKCs亚型的激活,而PKA以及Rho-Rock信号通路似乎没有参与。