FK506和红霉内酯H是从微生物的发酵产物中分离得到的大环内酯类天然产物。FK506又名他克莫司，是一种产自土壤链霉菌的免疫抑制剂，而红霉内酯H则是一种来自红色放线多孢菌的新型红霉素母核结构。在本课题中，我们针对这两种活性化合物的生物合成机制和产量提高展开研究。　　经种属鉴定，发酵产生FK506的原始菌株属于筑波链霉菌。我们建立了高效的筑波链霉菌遗传转移系统，优化了稳定的菌种发酵和产物检测方法，构建了高质量的原始菌株基因组文库。根据巴豆酰CoA还原羧化酶的保守性序列设计简并性引物，扩增并验证了与FK506生物合成相关的基因片段。在此基础上，筛选得到涵盖完整FK506基因簇的3个重组黏粒，明确了编码FK506生物合成的全部基因序列。　　FK506骨架结构C-13位和C-15位的甲氧基侧链，以及C-21位的烯丙基侧链分别来源于甲氧基丙二酰ACP和烯丙基丙二酰CoA。编码这两种途径特异性前体生物合成的fkbGHIJK和tcsABCD均以亚基因簇的形式连续存在于FK506生物合成基因簇中。我们利用放线菌噬菌体Φ C31和VWB来源的两套位点特异性重组体系，分别向ZJU01染色体的特定位点倍增这两段基因，由此获得的基因重组菌株表现出FK506高产表型。向ΦC31和VWB识别位点同时倍增这两段基因，获得的工程菌株FK506发酵产量进一步提高。RT-PCR实验在转录水平上证明，fkbGHIJK和tcsABCD的倍增分别引起了甲氧基丙二酰ACP和烯丙基丙二酰CoA生物合成的强化。我们发展了一套高效的基于位点特异性重组的遗传操作体系，提出了一种通过强化途径特异性前体的体内供给获得高产菌株的代谢工程改造策略，由此获得的高产菌株的FK506发酵产量提高了约130％。以遗传稳定的FK506高产菌株为研究对象，进行营养组分的优化。使用改良后的发酵培养基，高产菌株的FK506产量提高了约4倍。通过15L发酵罐的小试实验，我们以溶氧≥40％、pH6.8±0.2作为发酵工艺放大的关键参数，高产菌株的FK506产量相比工艺优化前提高了约18.7％。使用小试发酵工艺参数进行100L发酵罐中试实验，发酵规律的重复性良好。结合高产菌株的遗传改造和发酵工艺的优化放大，FK506的发酵产量从46.9 mg/L提高到697.2 mg/L，为工业化应用打下了坚实的基础。　　FK506及其结构类似物FK520、雷帕霉素都含有α-酮酰胺结构，该结构是在骨架后修饰过程中形成的。通过同框缺失特异性敲除P450氧化酶基因fkbD，获得的突变株发酵累积中间体9-脱氧-FK506。纯化蛋白FkbD的体外测活证明由其催化的C-9位连续两步氧化。fkbM和fkbDM同框缺失突变株分别能够发酵累积中间体31-O-脱甲基-FK506和9-脱氧-31-O-脱甲基-FK506，提示FK506的结构后修饰包含两条平行的途径。以9-脱氧-31-O-脱甲基-FK506为底物进行体外测活，验证了FkbD的四电子氧化活性。SAM甲基转移酶FkbM分别能以31-O-脱甲基-FK506和9-脱氧-31-O-脱甲基-FK506为底物，催化C-31位的羟甲基化。FkbD和FkbM的动力学参数说明两者都具有相对宽泛的底物选择性，验证了后修饰平行途径的存在。　　通过红色放线多孢菌YIM90600的全基因组测序，我们获得了其中的红霉素生物合成基因簇。该基因簇与红色糖多孢菌中的红霉素基因簇同源性很高，但是缺少了β-葡糖苷酶基因eryBI和O-甲基转移酶基因eryG。发酵产物与基因型的关联分析提示，新型红霉素母核的生物合成可能与YIM90600体内具有特殊催化活性的蛋白有关。具体地，针对红霉内酯H的环氧乙烷基结构，我们推测是由YIM90600中的P450氧化酶EryF负责催化的。该蛋白可能具有四电子氧化活性，在催化6-dEB C-6位羟化的同时，还能继续氧化红霉内酯B形成6，18-环氧红霉内酯B。我们从红霉素A高产菌株出发，分别构建eryF和eryBV的同框缺失突变株，同时确定了6-dEB和红霉内酯B的分离检测条件。同源EryF的体外测活实验成功证实了两者均能催化6-dEB转化为红霉内酯B，而在YIM90600来源的EryF的体外测活体系中，还可能有少量的6，18-环氧红霉内酯B生成。与此同时，我们还向eryF同框缺失突变株回补YIM90600来源的eryF，基因回补菌株能够恢复红霉素A、B、C、D的生物合成，却无法获得红霉内酯H的高产表型。　　本论文不仅完善了FK506的生物合成机制和提出了红霉内酯H的产生机制，而且通过代谢工程技术和生物过程优化相结合的策略大幅度提高了重要免疫抑制剂FK506的生产水平。这些工作将对这两类大环内酯的组合生物合成和生产水平进一步研究都具有重要的理论意义和工程价值。