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目的研究不同中医证型的膝骨关节炎(Osteoarthritis, OA)患者关节液中Toll样受体(Toll like receptor,TLR)通路相关炎性细胞因子IL-1β等蛋白表达情况,分析其与中医证型之间的相关性,为中医辨证寻求客观指标。通过制作不同程度的大鼠OA模型,检测其滑膜组织中TLR4的转录和表达水平,研究TLR4在OA不同阶段及滑膜炎症中表达差异的意义。研究通络止痛法君药桂枝的有效成分桂皮醛对于脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的大鼠膝关节滑膜细胞上TLR4/NF-kB信号通路的干预作用,探讨通络止痛外治法对于膝OA滑膜炎症的治疗作用及机制。方法1、临床研究：收集北京中医药大学第三附属医院骨科门诊符合临床膝OA和膝痹病的诊断标准、纳入标准,经过排除标准筛选的患者50例病例进行研究。记录患者的年龄、性别、病程等人口基线资料、膝关节X线Kellgren-Lawrence (K-L)放射学分级、Lysholm膝OA患者关节功能评分、视觉疼痛模拟评分(Visual Analogue Scale/Score, VAS)、关节液中细胞炎症因子IL-1β等蛋白表达情况。将这些指标与膝OA中医证型进行相关性分析,从中寻找能够指导中医辨证分型的特异性指标。2、动物实验研究：取190-210g成年Wsiatar大鼠80只,每组16只,分为正常对照组、假手术组、造模2、4、6W组,造模组利用经典Hulth法建立轻度、中度、重度大鼠膝OA动物模型,通过观察软骨形态学变化确定其病变程度。利用Real-time PCR观察滑膜细胞中TLR4、NF-kB在大鼠OA各病变阶段的转录表达情况,分析TLR4/NF-Kb mRNA的表达在大鼠OA及滑膜细胞炎症反应中的意义。3、细胞实验研究：取材并培养大鼠膝关节滑膜细胞,取第3-5代细胞,加入lOmg/L浓度的LPS进行诱导,利用Elisa检测桂皮醛干预后,滑膜细胞上清液中炎性因子IL-1β的定量表达情况,利用Western-blot检测TLR4蛋白的表达水平,与对照组及未加桂皮醛干预的LPS诱导组进行比较,探讨桂皮醛对于TLR4信号通路的干预作用。结果第一部分本研究最终纳入研究人数42例。在中医证型分布上,肝肾亏虚、痰瘀交阻病例人数高于肝肾不足、筋脉瘀滞和脾肾两虚、湿注骨节两组。肝肾不足、筋脉瘀滞X线等级较脾肾两虚、湿注骨节为轻差异有统计学意义(p<0.05),肝肾亏虚、痰瘀交阻病人X线等级与脾肾两虚、湿注骨节比较差异有极显著意义(p<0.01)。肝肾不足、筋脉瘀滞患者的Lysholm功能评分要好于其它两组(p<0.01),脾肾两虚、湿注骨节功能评分要高于肝肾亏组、痰瘀交阻证患者,但是差异没有统计学意义(p>0.05)。肝肾不足、筋脉瘀滞型分值最高,膝关节活动功能最好。各组患者不同证型之间的疼痛评分有显著性差异(p<0.05)。肝肾不足、筋脉瘀滞患者疼痛较轻,脾肾两虚、湿注骨节及肝肾亏虚、痰瘀交阻患者疼痛分值明显升高,但二者之间评分没有统计学差异(p>0.05)。肝肾亏虚、痰瘀交阻证及脾肾两虚、湿注骨节型患者中IL-1β含量明显高于肝肾不足、筋脉瘀滞证型的含量检测结果,有极显著统计学差异(p<0.01),肝肾亏虚、痰瘀交阻患者关节液IL-1β水平高于脾肾两虚、湿注骨节证型,但无统计学差异(p>0.05)。第二部分在造模2、4、6W时间节点上,大鼠滑膜组织TLR4 mRNA的表达水平随造模时间的延长而降低,但均明显高于正常组(P<0.05)；在三个时间节点上造模2周时,TLR4 mRNA的表达水平最高。随造模时间的延长,大鼠滑膜组织NF-kB mRNA的表达逐渐升高,且均显著高于正常组(P<0.05)；当造模4W后,NF-kB mRNA的表达较之前显著提升。造模后2W起,大鼠滑膜组织TLR4、NF-κB mRNA均有明显阳性表达(P<0.05),但前者随造模时间延长逐渐减低,后者随造模时间延长逐渐升高,且趋势明显。第三部分空白对照组细胞培养液上清中IL-1β水平没有达到试剂盒的最低检测浓度；LPS组上清IL-1 β水平高于桂皮醛干预组,二者比较有统计学差异(p<0.05)。和空白对照组进行比较,LPS组和桂皮醛干预组TLR4表达均明显增加,差异有极显著统计学意义(p<0.01)；经桂皮醛干预后大鼠滑膜细胞表达TLR4有所减少,差异有统计学意义(p<0.05)。结论膝OA的X线K-L分级、关节液中的IL-1β表达水平在不同证型间有明显的差异性,因此可以作为指导中医辨证的参考。肝肾不足、筋脉瘀滞患者病情一般相对较轻,肝肾亏虚、筋脉瘀滞证多数患者在X线等级、关节活动功能、疼痛方面评价均为膝OA末期阶段,病情最为严重。不同程度OA病变滑膜炎症与TLR4、NF-κB的表达之间存在显著的相关性。可以为进一步探寻针对OA各环节的靶向治疗、制定有效治疗方案、控制OA病情进展、判断OA预后提供实验参数。桂皮醛能够通过抑制LPS诱导的大鼠滑膜细胞TLR4蛋白表达的上调,能够抑制滑膜炎症反应,减少滑膜组织对炎性介质的分泌。