胰岛再生源蛋白Reg(regenerating islet-derived protein,Reg)家族的成员是涉及炎症,细胞增殖,细胞凋亡和抗菌作用的多功能蛋白质。已经显示Reg家族成员在胰腺的急性炎症中具有抗炎作用,其中,RegⅢγ作为一种多功能蛋白,与各种组织损伤和炎症反应有关。已知,肝巨噬细胞是肝组织损伤或炎症发生后首先招募的重要细胞,其活化产生的炎症因子可作用于肝细胞,促进静止的肝细胞进入细胞周期,启动肝再生。然而,关于RegⅢγ如何调控肝巨噬细胞的增殖与炎症反应的机理尚不明确,为此,本课题拟探究RegⅢγ对小鼠巨噬细胞RAW246.7炎症与增殖作用及机理。本文采用基因敲除(CRISPR/Cas9系统)和内源性基因添加(慢病毒侵染)的方法,成功获得了RegⅢγ敲除(RegⅢγKO)和RegⅢγ过表达的阳性单克隆细胞株,采用MTT、EdU、流式细胞术检测RegⅢγ对小鼠巨噬细胞RAW264.7生存活力及增殖的影响,结果显示,RegⅢγKO后,RAW264.7的活力明显下降,细胞周期进程减缓,而RegⅢγ过表达后RAW264.7的活力显著增强、细胞周期进程明显加快。EdU法检测结果发现RegⅢγ过表达促使处于增殖期的细胞比例显著增加,而RegⅢγ-/-组显著低于WT组。接着WB检测结果发现RegⅢγ过表达促进CCNA2蛋白的显著上调,而RegⅢγ敲除后CCNA2的蛋白表达受到显著抑制。推测RegⅢγ基因能够诱导CCNA2蛋白的表达,进而促进细胞的周期运转和增殖。本文通过检测NO的释放量、中性红吞噬实验和Transwell等方法判断RegⅢγ对RAW264.7细胞炎症作用的影响,结果发现RegⅢγ缺失后RAW264.7细胞释放的NO明显增多,吞噬和迁移能力下调明显STAT3、Akt和p65的磷酸化增强,但抗炎因子HO-1和IL-10的表达受到明显抑制、炎症因子TNF-α的表达明显上调;而RegⅢγ过表达后,RAW264.7的吞噬能力增强,能通过降低STAT3、Akt和p65的磷酸化而抑制STAT3、Akt、NF-κB通路,且伴随NO的释放减少、抗炎因子HO-1和IL-10的上调和促炎因子TNF-α的下调,说明RegⅢγ能够抑制RAW264.7细胞的炎症反应。瞬转RegⅢγ入RAW264.7细胞并采用免疫荧光检测发现,RegⅢγ主要表达在细胞质和细胞核中。免疫共沉淀结合Western Blot方法检测发现RegⅢγ可与受体EGFR结合,且RegⅢγ的敲除与过表达显著影响p-EGFR的表达,说明RegⅢγ可能通过受体EGFR发挥下游的调控作用。综上所述,RegⅢγ可能通过其受体EGFR调控STAT3、Akt、NF-κB信号通路的级联反应,进而抑制巨噬细胞的炎症反应、促进巨噬细胞的增殖。