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一、研究背景蜱（Ticks）作为一个多样性丰富的种群,是明确确定为可携带病原体的专性吸血节肢动物,与蚊子一样,是全球人类及家畜疾病的主要传播媒介。斑点热群立克次体（Spotted fever group rickettsia,SFGR）作为蜱传疾病中重要的一类病原体,在世界范围内引起大量人兽共患疾病。截止目前为止,在除南极洲外的六大洲均发现有SFGR的存在,超过15种SFGR已证实可引起人类疾病,而在我国大陆已发现20余种SFGR。并且随着分子技术的发展,越来越多的SFGR被发现。由于SFGR分离技术的局限性,目前获得分离株的SFGR还比较少,使得SFGR体外实验无法高效的展开,导致SFGR与节肢动物媒介的联系、脊椎动物作为宿主的重要性、动物感染与人群感染所表现出的症状差异、不同致病性物种和宿主细胞相互作用等方面的认识仍不清晰。与此同时,现阶段对于蜱的研究多数集中于广布种,对于狭域种的研究较少。猛突血蜱主要分布在我国西南地区,有关其生活习性及媒介作用的研究很少,有学者在猛突血蜱中检测到多种斑点热群立克次体分子型,并成功分离一株新发蜱传立克次体,提示其具备携带多种SFGR的可能性。因此选择对猛突血蜱携带SFGR展开筛查与分离。在获得分离株的基础上,加强对斑点热群立克次体基因组学、生物学特性的研究有助于了解立克次体的感染途径及作用机制;最后对多发、新发SFGR进行监测,对于发现和预防新的人类致病性立克次体是一个重要手段。二、研究目的（1）探索不同分离方法在新发蜱传立克次体分离中的运用;（2）了解新斑点热群立克次体的生物学特性;（3）了解新斑点热群立克次体自然环境中的分布情况;三、研究内容（1）建立猛突血蜱生态种群,并对其携带SFGR进行分离,获得新发蜱传立克次体分离株及其进化关系。（2）对新发蜱传立克次体进行鉴定,获得其全基因组序列信息;观察新发SFGR在体外实验中表现出的生物学特性,探讨其潜在致病性;（3）新发SFGR在自然环境中的流行病学特征,了解其在蜱中的分布情况。四、研究方法（1）将采自云南省的猛突血蜱在实验室条件下建立生态种群,观察其生活周期。挑选部分蜱样本研磨后进行细胞接种,随后利用空斑纯化分离实验对蜱携带两种混合的斑点热群立克次体进行分离。分离后提取立克次体DNA,对其特异性基因片段分析,确定其为新发蜱传立克次体。（2）对新发蜱传立克次体进行全基因组测序,分析其结构与功能;通过姬姆萨染色、超薄切片电镜观察立克次体形态学特征。绘制新发SFGR在不同细胞系生长曲线,观察其致细胞病变效应及空斑实验细胞毒性,描述新发SFGR生物学特性,探讨其对宿主细胞的侵袭能力和毒力作用以及对动物宿主、人群的潜在致病性。（3）利用分子技术,通过omp A基因对我国蜱多发的东北地区及西南地区多个省市采集的蜱标本进行SFGR感染情况调查,包括对新发SFGR的流行病学特征调查,了解其在自然环境中感染水平及与其他病原体复合感染情况。五、研究结果（1）发现并分离到一株新的SFGR,命名为R.erhaii。建立实验室条件下猛突血蜱生态种群,其生活周期约110-130天;将部分来源于同一母蜱的猛突血蜱若蜱接种至Vero81细胞。经培养后,证实获得SFGR分离株,并可在不同细胞中稳定生长;对分离株进行全基因组测序,序列结果提示分离株中可能包含两种不同的SFGR,根据空斑纯化实验,将形成的蚀斑挑出接种至新的细胞中培养,将两种SFGR成功分离。分别对两种SFGR特异性基因片段进行扩增及系统进化分析发现:其中一株SFGR为实验室前期分离的R.yunnanensis斑点热群立克次体;另一株比对后发现与现有立克次体不同。依据立克次体新种判定标准,证实为一种新的斑点热群立克次体,命名为R.erhaii。（2）R.erhaii基因组学及生物学特性研究。将R.erhaii进行全基因组测序,结果发现其G+C含量为32.5%,符合SFGR特征,并且与R.massiliae和R.rhipicephali进化关系最为接近。通过姬姆萨染色及超薄切片电镜观察形态学特征发现,R.erhaii呈长杆状、微小杆状及球状等形态,超微结构显示其具有立克次体典型双层膜结构,与其他SFGR相似。R.erhaii细胞内增殖研究发现,R.erhaii能在哺乳细胞及蜱细胞中生长,并且在Vero81细胞的载量远高于IDE8,提示存在感染动物宿主及人群的可能性。对R.erhaii的细胞毒性进行研究,通过比较几种SFGR的致细胞病变效应,发现R.erhaii相比于其他几种SFGR对细胞的毒性较小;空斑实验发现,R.erhaii所形成空斑为相对集中的片状形态,细胞变透亮,较高浓度时细胞才出现脱落,与R.yunnanensis相比,空斑形成速度更慢且细胞病变程度更弱。小鼠免疫实验发现,R.erhaii可引起小鼠抗体水平升高至1:1024,获得R.erhaii抗血清。（3）蜱中SFGR感染率调查及R.erhaii流行病学调查从我国东北地区及西南地区累计共采集蜱826只,经鉴定为5个属16个蜱种。筛查蜱中斑点热群立克次体分布情况,感染率为44.44%（356/801）,并且在不同蜱种中,SFGR的感染率不同。而在16个蜱种中,R.erhaii仅在云南剑川采集的猛突血蜱中检测到,其阳性率为38.71%,属于较高水平。R.erhaii还存在与嗜吞噬细胞无形体（A.phagocytophilum）、巴贝西原虫（Babesia sp.Bi CM002）复合感染情况,感染率分别为26.88%,1.08%。此外,对R.erhaii复合感染情况调查发现,R.erhaii与R.yunnanensis存在两种斑点热群立克次体复合感染的情况,复合感染率为24.73%。六、研究结论（1）猛突血蜱具备携带多种蜱传病原体的能力,包括斑点热群立克次体、无形体、巴贝西原虫等,提示其可能携带更多的病原体还未发现;同时猛突血蜱中还存在复合感染的情况,需要引起更多的关注及研究。（2）在采集的16个蜱种中,R.erhaii仅在猛突血蜱中检测到,不代表其只能由猛突血蜱携带,扩大采集地域、筛查不同种类蜱种及收集足够的样本量,有助于对R.erhaii的分布有更为明确的判断。（3）与传统认识不同的是,自然条件下猛突血蜱存在两种斑点热群立克次体复合感染的情况,这可能与两种斑点热群立克次体使用常规的通用引物不容易被发现有关。改变引物或是调整筛查策略,对更多的蜱种进行筛查,以此去验证两种斑点热群立克次体复合感染的现象是普遍存在或是偶然现象。（4）空斑形成实验不仅可以用于菌株的克隆化、生物学特性研究以及筛选敏感抗菌药,在立克次体分离中也可以发挥重要作用,一旦多种斑点热群立克次体复合感染的情况是普遍存在的,那么空斑纯化分离实验可以是一个很好的选择。