研究表明生长激素(growth hormone, GH)可作用于乳腺间质细胞的GH受体,诱导细胞产生胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor1, IGF-1)刺激乳腺腺泡的发育和增加乳腺血流量,达到维持泌乳和提高奶产量的作用。本研究首先利用基因打靶技术将山羊GH基因定点导入山羊β-酪蛋白基因座中,构建乳腺特异性基因打靶载体pLG,然后在细胞和乳腺组织中进行功能验证。最后将pLG转染山羊耳皮成纤维细胞进行筛选,为今后培育转GH山羊奠定试验基础。本研究中主要试验内容分为以下三部分：1.山羊β-酪蛋白基因5’和3’调控元件克隆及功能验证本试验的目的是扩增山羊β-酪蛋白的3’和5’调控元件,构建乳腺特异性打靶载体pGFP,通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达验证β-酪蛋白基因调控元件的功能。首先从新鲜采集的肝素抗凝山羊血中提取山羊基因组DNA, PCR扩增其3’和5’调控元件进行测序并分别双酶切插入打靶载体pLOXP II的SalⅠ/ClaⅠ与NotⅠ/XhoⅠ多克隆位点,得到的载体命名为pL5。然后将GFP序列通过Xho Ⅰ单酶切插入pL5载体的Xho Ⅰ多克隆位点,得到的载体命名为pGFP.将载体pGFP通过脂质体法转染Bcap-37细胞,6小时后换液去除脂质体并加入10%胎牛血清,转染后36小时在荧光显微镜观察。测序结果表明PCR扩增得到的山羊β-酪蛋白基因的3’和5’端调控元件序列,与GenBank中公布的相应序列同源性在99.5%以上,可以作为基因打靶载体的两侧同源臂使用。pGFP质粒转染组细胞荧光强度显著高于对照组,证明克隆的山羊β-酪蛋白基因3’与5’调控元件具有在细胞水平指导外源基因表达的生物学活性。2.山羊GH基因乳腺特异性打靶载体pLG的构建及其生物学功能验证将GH cDNA酶切插入pLG载体Xho Ⅰ多克隆位点,得到GH基因乳腺特异性打靶载体并将其命名为pLG。构建的乳腺特异性基因打靶载体pLG质粒采用脂质体法,分别导入人乳腺癌细胞Bcap-37和泌乳期山羊乳腺,转染后提取细胞裂解液和乳腺组织,采用RT-PCR和ELISA方法检测GH转录和表达水平。结果显示与空白组相比,转染pLG质粒组在细胞(P<0.01)和乳腺组织中(P<0.05)GH转录水平和蛋白表达量均显著提高,表明载体pLG可在乳腺细胞上和乳腺组织中成功转录和表达GH。试验结果显示构建的山羊GH基因乳腺特异性打靶载体可以应用到后续的转GH基因奶山羊生产研究中。3.山羊GH基因乳腺特异性打靶载体pLG转染山羊胎儿成纤维细胞和细胞筛选将pLG质粒通过脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞,转染后36h加入G418(600ng/mL)进行正筛选,10d后山羊胎儿成纤维细胞出现明显单克隆集落。将G418浓度降至300ng/mL并加入丙氧鸟苷(4umoL/mL)负筛选,7d后挑取单克隆集落消化传代至48孔细胞培养板进行连续扩培,扩培至6孔板后提取单克隆基因组DNA并冻存细胞。试验结果表明共筛选到36个单克隆细胞株,PCR检测结果显示其中有5个单克隆细胞株正确整合。