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黄脸油葫芦Teleogryllus emma Ohmachi&Matsuura属昆虫纲Isecta,直翅目Orthoptera,蟋蟀科Gryllidae,油葫芦属Teleogryllus。近年来,因黄脸油葫芦能入药、可食用,亦可观赏等特殊的经济价值,而得到广泛养殖。由于气候条件改变和生物防治技术缺乏,野生蟋蟀得到大量繁殖,导致农田蟋蟀发生危害的趋势明显上升。因此,了解蟋蟀蜕皮与生殖的调控机制,从而提高特种养殖效益和改善田间防治措施显得尤为重要。昆虫的蜕皮和变态受到蜕皮类固醇激素（Ecdysteroid hormones,EH）和保幼激素（Juvenile hormone,JH）调控。其中,EH经一系列羟化和氧化反应后,在靶组织中转变成为20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）的活性形式,再与蜕皮激素受体（Ecdysone,EcR）和超气门蛋白（Ultraspiracle,USP）二聚体结合形成20E-EcR-USP复合体。20E-EcR-USP复合体募集一些共激活因子后与蜕皮激素应答元件（Ecdysone response element,EcRE）结合,继而引发下游应答基因E74A,E75B和HR3等的级联应答,调控昆虫蜕皮、变态和生殖。此外,热休克相关蛋白70（Heat shock cognate protein 70,Hsc70）和热休克蛋白 90（Heat shock protein 90,Hsp90）可作为EcR-USP复合体的组成部分,促进EcR的结合活性。然而20E在直翅目昆虫生殖方面的角色还有待进一步完善。雌激素相关受体（Estrogen relative receptor,ERR）属核受体超家族成员,与雌激素受体（Estrogen receptor,ER）高度同源,不与雌激素结合,对天然雌激素的刺激不产生应答,至今未发现其天然配体。在共激活因子作用下,ERR与雌激素受体应答元件（Estrogen receptor response element,ERE）结合,并启动一系列的基因表达,进而调控雌、雄生殖系统的正常发育。此外,EcRE序列具有与ERE的“AGGTCA”非常相似的“GGTCA”保守基序。因此,ERR是否也能与EcRE结合,进而调控20E信号参与昆虫生殖呢?本研究以黄脸油葫芦为实验对象,采用RNA干扰（RNAinterference,RNAi）敲低性腺中TeERR,TeEcR,TeHsc70和TeHsp90的表达,并运用qPCR检测TeERR与20相关基因的表达,以探讨TeERR,TeEcR,TeHcR70和TeHsp90在性腺发育和功能维持中的作用以及TeERR与TeEcR的关联性。研究结果如下:1.在黄脸油葫芦成体精巢中克隆和鉴定了RXR,E75B,HR3,Hsc7 和Hsp90部分 cDNA 序列,并运用 qPCR 检测TeRXR,eE75BOTeHR3,TeHsc70和TeH90在蟋蟀性腺发育过程中的表达。核酸序列比对分析显示,黄脸油葫芦RXRE75B,HR3,Hsc70和Hsp90序列与其他昆虫相应基因的序列具有高度同源性,故定名为TeRXR,TeE75B,TeHR3,TeHsc70和TeHsp90。经20E处理后,黄脸油葫芦成体精巢中TeEcR,TeRXR,TeE75B,TeHR3,TeHsc70和TeHsp90受到不同程度的抑制。TeERR和20E相关基因在4,5,6龄若虫和成虫性腺中均有表达。有趣的是在性腺发育过程中TeERR与20E相关基因在同一龄期精巢中的表达并不总是同步,并且与同一龄期卵巢中的表达相比也并不同步。此外,TeERR,TeEcR和TeE75B在卵巢的表达显著高于相应龄期精巢中的表达（n=5,P<0.05）。总体来看,TeERR,TeEcR,TeRXR,Te75B,TTeHR3,TeHsc70和TeHsp90的表达与性腺发育各阶段之间的关系并不总是单调相关。本研究结果表明ERR和20E相关基因应答外源性20E激素,并且参与调控性腺发育和维持成体性腺功能。其中,ERR,EcR和E75B主要参与卵巢发育。2.本研究以雄性黄脸油葫芦成体为实验对象,设实验组、阴性对照组和空白对照组。实验组注射dsTeERR/dsTeEcR,阴性对照组注射dsEGFP。dsTeERR组以400,700,1000,2000和3000 ng剂量注射,干扰36和48 h后检测RNAi效率,并选择最佳干扰剂量和时间;dsTeEcR组以2000 ng注射,干扰48,72和96 h后取材以检测RNAi效率以选择最佳干扰时间。以敲低TeERR或TeEcRmRNA的精巢为样本,检测TeERR/TeEcR敲低后TeEcR/TeERR mRNA和蛋白质表达以及精巢的形态和重量变化。结果显示2000 ng dsTeERR/dsTeEcR干扰48 h后精巢中TeERR/TeEcRmRNA表达均显著下调（n=3,P<0.05）。dsTeERR干扰后TeEcR mRNA和蛋白的表达显著下调（n=3,P<0.05）,并且dsTeEcr干扰后TeERR mRNA和蛋白的表达也显著下调（n=3,P<0.05）。此外,TeERR和TeEcR主要定位于精原细胞,并且dsTeERR/dsTeEcR干扰会导致精巢形态缺陷,但对精巢的重量无显著影响（P>0.05）。以上结果表明ERR与EcR密切相关,参与20E信号通路,并且维持成体昆虫精巢功能。3.本研究以雄性黄脸油葫芦成体为实验对象,设实验组、阴性对照组和空白对照组。实验组注射dsTeTHsc70,dsTeHsp90和dsTeHsc70 + dsTeHsp90,阴性对照组注射dsEGFP,干扰48,72和96 h后qPCR检测RNAi效率和20E相关基因的表达。此外,第3章内容已发现dsTeERR干扰后黄脸油葫芦成体精巢中TeEcR mRNA和蛋白质的表达被显著敲低,并且dsTeEcR干扰后黄脸油葫芦成体精巢中TeERR mRNA和蛋白质的表达也能被显著敲低。因此,本节内容也检测了 dsTeERR/dsTeEcR 干扰后 TeEcR,TeERR,TeRXR,TeE75B,TeHR3,TeHHsc70 和 TeHHsp90的表达,以探讨TeERR和TeEcR与20E初、次应答基因的关系。结果显示dsTeERR和dsTeEcR干扰均可导致TeEcR,TeERR,TeRXR,TeHR3和TeHHsc70表达显著下调（n=3,P<0.05）,以及TeE75B和TeHsp90表达上调。dsTeHsc70 + dsTeHsp90干扰不仅导致TeEcR,TeRXR,TeE75B和TeHR3 mRNA表达均显著下调（n=3,P<0.05）外,还能显著下调（n=3,P<0.05）TeERR mRNA的表达。dsTeHsc70干扰可导致TeERR,TeEcR,TeRXR,TeE75B和TeHR3 mRNA的表达显著下调（n=3,P<0.05）,并且TeHsp90 mRNA的表达显著上调（n=3,P<0.05）;dsTeHsp90干扰后TeRXR,TeE75B和TeHR3 mRNA的显著下调（n=3,P<0.05）,但对TeERR,TeEcR和TeHsc70 mRNA的表达无显著影响。由此看来,ERR和EcR处于20]E相关基因的上游,二者对于精巢的发育和形态建成必不可少;Hsc70可与ERR和EcR互相作用,并处于RXR的上游,参与调控20E应答基因E74A,E75B和HR3的表达。4.本研究采用外源性20E诱导和RNAi来探讨TeERR和20E应答基因在黄脸油葫芦卵巢发育中的作用。本研究以雌性黄脸油葫芦4龄期和6龄期若虫为实验对象,设实验组、阴性对照组和空白对照组。在20E诱导实验中,实验组注射500 ng 20E,阴性对照组注射DMSO,处理1,3,6,12和24 h后检测TeERR和20E相关基因的表达。在RNAi实验中,实验组注射dsTeERR/dsTeEcR,阴性对照组注射dsEGFP,干扰48 h后qPCR检测RNAi效率和20E相关基因的表达。结果显示20E处理和dsTeEcR干扰后4龄期和6龄期若虫卵巢中TeERR,TeEcR TeRXR,TeHR3,TeHsc70和TeTHsp90表达显著下调（n=3,P<0.05）,而E75B的表达显著上调（n=3,P<0.05）。dsTeTeERR干扰后4龄期若虫卵巢中TeERR,TeEcR,TeRXR,TeHR3,TeHsc70和TeHsp90表达显著下调（n=3,P<0.05）,而E75B的表达却显著上调（n=3,P<0.05）;6龄若虫卵巢中TeERR,TeEcR,TeRXR,E75B,TeHR3 TeHsc70和TeHsp90表达均显著下调（n=3,P<0.05）。以上结果表明ERR和EcR对于卵巢中20E信号应答必不可少,并且二者参与卵巢发育。5.本研究以雌、雄性黄脸油葫芦4龄期若虫为实验对象,设实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组注射dsTeERR/dsTeEcR,阴性对照组注射dsEGFP。对比分析dsTeEcR干扰后黄脸油葫芦4龄期若虫精、卵巢中20E应答基因的表达。结果显示dsTeEcR干扰后4龄期若虫精、卵巢中TeERR,TeRXR,eeHR3,TeHsc70和TeHsp90表达显著下调（n=3,P<0.05）;E75B的表达在精巢中显著下调（n=3,P<0.05）,卵巢中却显著上调（n=3,P<0.05）。此外,TeERR,TeEcRcR,TeRXR,E75B和TeHR3在卵巢中的表达均显著高于精巢中的表达,而TeHHsc70和TeHsp90精巢中的表达均显著高于卵巢中的表达。结果表明ERR,EcR,RXR,E75B和HR3主要参与卵巢发育,Hsc70和Hsp90主要参与精巢发育。综上所述,本研究通过RNAi和外源性20E诱导后检测TeERR,TeEcR,TeRXR,E75B,TeHR3,TeHHsc70和 TeHHsp90表达,探讨了 TeERR与 TeEcR 的关系,以及 TeERR,TeEcR,TeHsc70和TeHsp90在20E信号级联中的作用,明确TeERR,TeEcR,TeHsc70和TeHsp90参与卵巢发育和精巢功能维持,并且对于精、卵巢中20E信号应答必不可少。