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目的腹膜纤维化(peritonealfibrillation,PF)是导致腹膜透析(peritonealdialysis,PD)效能下降的重要因素。在PF一系列病理改变中,腹膜间皮细胞(peritonealmesothelialcells,PMCs)发生上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是起始与可逆环节,多条信号传导途径的参与调控这一过程。本研究的第一部分拟检测PD患者腹透流出液中的TGF-β1、β-catenin表达水平,为深入探讨Wnt/β-catenin信号传导调控EMT机制、研究PF干预手段提供循证支持;第二部分拟分别运用体内/体外模型证明Wnt/β-catenin信号通路参与调控PMCsEMT,并阐明黄芪对通路介导的EMT的调控作用,深入探讨黄芪抗PF机制。方法第一部分:收集6个月≤透析龄≤2年和透析龄≥2年的PD患者腹透流出液各16例,ELISA检测腹透液中游离TGF-β1和β-catenin细胞因子的表达。提取各组PD患者腹透液脱落细胞,RT-PCR检测β-catenin mRNA表达。第二部分:在体研究:腹腔注射高糖腹透液诱导建立PF大鼠模型,观察Wnt/β-catenin信号在大鼠腹膜EMT中的变化及黄芪对大鼠腹膜EMT及纤维化的影响。雄性SD大鼠,随机分为8组,每组15只。空白组:正常饲养;阴性对照组:每日腹腔注射NS20mL/只,共35d;模型组:每日腹腔注射4.25%葡萄糖腹透液20mL/只,共35d;黄芪单独处理组:每日腹腔注射生理盐水20mL/只,于第15d加入黄芪注射液,黄芪终浓度40mg/mL;低、中、高剂量黄芪治疗组:腹腔注射4.25%葡萄糖腹透液,于第15 d加入不同浓度的黄芪注射液,黄芪终浓度分别为10、20、40mg/mL;黄芪预先干预组:每日腹腔注射4.25%葡萄糖腹透液20mL/只+黄芪40mg/mL,共35d。HE、Masson染色观察腹膜病理,免疫组化检测腹膜纤维化指标(collagenI)、EMT 指标(a-SMA、E-cadherin)、β-catenin。提取大鼠大网膜组织RNA,RT-PCR检测β-catenin及下游信号指标(Axin、LEF1)mRNA的表达。离体研究:①采用不同浓度TGF-β1(5-20ng/mL)诱导人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)24h,以l0ng/μL TGF-β1诱导HMrSV5不同时间(6-48 h),观察细胞EMT标志物(a-SMA、E-cadherin、Vimentin)的表达情况,以及β-catenin及通路下游指标(CyclinD、c-Myc)的变化,探讨TGF-β1诱导HPMCsEMT的最佳条件及Wnt/β-catenin信号在这一过程中的变化。②用β-catenin siRNA进行瞬时基因敲减,检测TGF-β1诱导后野生型与β-catenin knockdown的两组细胞EMT指标变化及EMT转录因子(Snail、Slug)mRNA的表达,并观察细胞形态变化。③TGF-β1(10ng/mL)作用于HMrSV5 6-72h后,检测核内β-catenin表达量;以TGF-β1+黄芪不同浓度(20-800mg/mL)干预24h,检测核内β-catenin变化趋势;免疫荧光观察黄芪对TGF-β1诱导的β-catenin细胞内定位的影响;相差显微镜观察黄芪对TGF-β1诱导的细胞形态的影响;分别给予细胞TGF-β1和TGF-β1+黄芪,观察黄芪对EMT标记蛋白、β-catenin及其下游蛋白的影响;β-catenin敲减后分别给予细胞TGF-β1和TGF-β1+黄芪,检测敲减β-catenin对黄芪干预EMT标记蛋白的影响。④免疫沉淀观察HMrSV5 EMT中β-catenin与GSK-3β的结合情况及黄芪干预作用;Western blot检测该模型中p-β-catenin、GSK-3β、β-GSK-3β的表达及黄芪的影响。结果第一部分:与透析龄小于2年的PD患者相比,PD超过2年的患者腹透流出液中TGF-β1,β-catenin因子水平更高(P<0.5);RT-PCR结果示PD超过2年的患者腹透液脱落细胞具有更高的β-catenin mRNA表达。第二部分:在体研究:高糖腹透液能破坏间皮细胞层,明显增加大鼠腹膜厚度,促进胶原增生及炎性浸润,不同剂量黄芪处理可以浓度依赖性降低PF程度,减轻胶原沉积,NS和黄芪单独处理对大鼠腹膜结构没有明显影响。高糖腹透液诱导大鼠腹膜α-SMA、Collagen Ⅰ、β-catenin表达上调,E-cadherin下调,黄芪处理可以抑制上述改变。黄芪能抑制PF大鼠腹膜β-catenin及下游信号Axin、LEFmRNA的表达。离体研究:①TGF-β1能诱导 HPMCs 发生 EMT,以 10ng/mL 干预 24h 最为显著,β-catenin、CyclinD、c-Myc 同时被激活。②β-catenin基因敲减抑制TGF-β1诱导的PMCs EMT,并改善了 EMT细胞形态学变化。③随着TGF-β1作用时间延长,核内β-catenin进行性增多,24h达高峰;黄芪减少核内β-catenin蛋白表达的同时上调胞浆β-catenin水平,呈浓度依赖性;黄芪抑制TGF-β1介导的β-catenin核转位;黄芪通过抑制Wnt/β-catenin信号相关蛋白,阻抑HMrSV5 EMT;β-catenin敲减不能消除黄芪对抗EMT的功能。④HMrSV5细胞生理状态下GSK-3β和β-catenin存在相互作用,黄芪能增强两者结合能力。TGF-β1对总GSK-3β表达无影响,但能明显促进GSK-3β的磷酸化,p-β-catenin则被抑制,黄芪一定程度上抑制了上述改变。结论①PD患者腹透流出液中β-catenin、TGF-β1水平升高,其表达与透析龄相关。② Wnt/β-catenin信号在高糖腹透液诱导的PF大鼠中被激活,黄芪能抑制其介导的大鼠腹膜EMT及纤维化。③Wnt/β-catenin信号通路调控TGF-β1介导的PMCsEMT,黄芪通过调控该信号途径阻抑PMCs EMT过程。④黄芪调控β-catenin通路的机制在于抑制TGF-β1介导的GSK-3β磷酸化,恢复胞浆中GSK-3β与β-catenin结合,促进β-catenin磷酸化,降低游离β-catenin蛋白水平。