论文部分内容阅读
棉蚜Aphisgossypii是世界性分布的重要农业害虫,在我国北方棉区发生较重,通过直接取食和间接传播病毒给农作物造成严重损失。棉蚜是多食性害虫,寄主众多,在长期进化过程中形成了不同的寄主专化型,我国以棉花型和黄瓜型最为典型。细胞色素P450氧化酶（P450s）和谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）是生物体内广泛存在的超基因家族酶类,在昆虫体内对内源物质的合成与降解以及植物次生物质和杀虫剂等外源物质的代谢中发挥着重要的作用。蚜虫寄主专化型的形成受多种因素的影响,昆虫对寄主植物次生物质的代谢能力差异在昆虫与寄主的协同进化中起着重要的作用。本研究根据棉蚜转录组相关信息,分别克隆了表达量较高的3个谷胱甘肽-S-转移酶基因和3个细胞色素P450氧化酶基因,研究了棉花型和黄瓜型棉蚜中这6个基因的表达谱并分析其表达差异;利用RNAi技术对细胞色素P450基因CYP6CY19进行了干扰,并观察干扰后蚜虫对棉花和黄瓜的适应性差异,研究结果为探索棉蚜寄主专化型形成的分子机制提供重要的信息。1.3个(GST基因在两种专化型棉蚜中的表达差异分析根据棉蚜转录组数据,克隆得到了3个高表达GST基因的cDNA全长序列,分别是:AgoGST-s1（Genbank 登录号:MN688789）,其 612 bp 的 ORF 编码 203 个氨基酸残基,预测蛋白质分子量为23.14 kDa;AgoGST-d1（Genbank登录号:MN688790）包括651 bp的ORF,编码216个氨基酸,预测蛋白质分子质量为24.17 kDa;AgoGST-d2（Genbank登录号:MN688791）包括666 bp的ORF,编码221个氨基酸,预测相对分子质量为24.89 kDa。序列与蛋白结构分析表明,这3个基因在N端和C端都分别含有GST基因典型的GSH结合位点（G-site）和疏水底物结合位点（H-site）,AgoGST-s1包含Simga家族特有的催化残基位点“Y8”,AgoGST-d1和AgoGST-d2含有Delta家族特有的典型序列“T*AD”,空间结构都是由9个α螺旋和4个β折叠共同组成的蛋白三级结构。理化性质分析显示,等电点为5.2～7.0,平均疏水性为-0.07～-0.17,均属于亲水性蛋白。氨基酸序列同源性比对和系统发育树分析发现,棉蚜的3个GST基因和其他昆虫GST基因的同源性较高,并且和半翅目昆虫豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的进化关系最近。用荧光定量PCR检测这3个GST基因在不同专化型棉蚜不同发育阶段的表达量,在棉花型和黄瓜型棉蚜中,AgoGST-s1、AgoGST-d1、AgoGST-d2基因在不同发育阶段的表达谱大体一致,且随着龄期的增加表达量呈现出由低到高的变化趋势。但是比较两种寄主专化型棉蚜,发现几乎在整个发育历期,黄瓜型蚜虫AgoGST-s1、AgoGST-d1、AgoGST-d2基因的表达量都显著高于棉花型蚜虫,最大差异分别为3倍、7倍和5倍。AgoGST-s1、AgoGST-d1、AgoGST-d2在不同寄主专化型棉蚜体内的表达量存在差异,可能与棉蚜对寄主植物的适应性有关。2.3个P450基因在两种专化型棉蚜中的表达差异分析根据棉蚜转录组数据,克隆得到了3个高表达的P450基因的cDNA全长序列,分别是AgoCYP4G51（GenB ank 登录号:MT268657）,其 1701 bp 的 ORF 编码 566个氨基酸,预测蛋白质分子量为64.52 kDa;AgoCYP6CY7（GenB ank登录号:MT268658）包括1554 bp的ORF,编码517个氨基酸,预测蛋白分子质量为59.15 kDa;AgoCYP6CY19（GenBank 登录号:MT268651）包括 1542 bp 的 ORF,编码 513 个氨基酸,预测分子质量为59.27 kDa。序列与蛋白结构分析表明,这3个基因含有P450基因5个典型的保守区,分别为螺旋C上WxxxR序列、螺旋Ⅰ上的（GxE/DTT/S）序列、螺旋K上ExLR序列、“Meander”区域上PxxFxPE/DER序列以及血红素结合区的PFxxGxRxCxG/A序列,空间结构是由19～23个α螺旋和9-12个β折叠共同组成的蛋白三级结构。理化性质分析显示,等电点为6.5～8.0,平均疏水性为-0.08～-0.23,均属于亲水性蛋白。氨基酸序列同源性比对和系统发育树分析发现,棉蚜的3个P450基因保守区和其他昆虫P450基因同源性较高,在进化关系上与半翅目昆虫豌豆蚜A.pisum、大豆蚜Aphis glycines聚为同一分支。用荧光定量PCR检测P450基因在不同专化型棉蚜不同发育阶段的表达量,结果表明,除若蚜2龄和成蚜7日龄外,在棉花型棉蚜中AgoCYP4G51、AgoCYP6CY7、AgoCYP6CY19基因在各个发育阶段的表达谱基本相似,且大部分时期表达量都呈现出由低到高的变化趋势,而在黄瓜型棉蚜中这3个表达量则呈现出呈稳定状态。比较棉花型和黄瓜型棉蚜中基因的表达量,发现几乎在棉蚜整个发育历期,棉花型蚜虫中AgoCYP4G51、AgoCYP6CY7、AgoCYP6CY19基因的表达量都显著高于黄瓜型棉蚜,最大差异分别为35倍、16倍和11倍。3.干扰棉蚜CYP6CY19基因对寄主适应性的影响本章通过体外涂抹dsRNA制剂,抑制棉蚜4龄若蚜和2日龄成蚜体内CYP6CY19基因的表达,对比棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜的蜕皮率、产仔量以及死亡率等,探究干扰CYP6CY19基因后对棉蚜寄主适应性的影响。结果显示1μg/μL的dsRNA制剂干扰效果最好,其中涂抹后24 h,棉花型棉蚜4龄若蚜RNAi效率可达75%,显著高于黄瓜型棉蚜4龄若蚜47%;涂抹后48 h,棉花型棉蚜2日龄成蚜中RNAi效率为86%,略高于黄瓜型棉蚜2日龄成蚜表达量81%。观察两种专化型棉蚜的蜕皮率发现,干扰后的任何时间对两种专化型棉蚜4龄若蚜的蜕皮率都没有影响。观察两种专化型棉蚜2日龄成蚜的产仔量,发现干扰后36-60h内,与对照组相比,棉花型棉蚜2日龄成蚜平均每日每雌产仔量为5.3头,显著低于对照组10.3头,在36-84 h,其平均每雌总产仔量降低32%,相反,对黄瓜型棉蚜没有显著影响。观察两种专化型棉蚜4龄若蚜和2日龄成蚜的死亡率,发现干扰后48h棉花型棉蚜4龄若蚜死亡率最高,为65%,显著高于黄瓜型棉蚜4龄若蚜43%,干扰后24h棉花型棉蚜2日龄成蚜死亡率最高,为46%,略低于黄瓜型棉蚜2日龄成蚜55%。本研究证实了棉花型棉蚜中的RNAi干扰效率高于黄瓜型棉蚜,干扰掉CYP6CY19基因后,影响了棉蚜的产仔量和存活率,对棉花型棉蚜的影响大于对黄瓜型棉蚜的影响,主要表现为产仔量减少和存活率降低。