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研究目的:系统性红斑狼疮（SLE）是一种以多器官受累,多种自身抗体产生及免疫学异常为特点的自身免疫性疾病,其中狼疮肾炎（LN）是常见且严重的并发症之一。该病主要发生于育龄期女性,病情进展快,预后不良。LN发病机制尚不明确,既往研究证实了炎症、氧化损伤等肾内因素,免疫细胞紊乱等全身因素均与狼疮肾炎发病及进展密切相关。自噬是细胞对代谢应激和环境变化的一种适应性反应,然而异常的自噬也能够打破免疫系统的稳态,参与免疫相关疾病发生发展。研究发现自噬对炎症和氧化应激有调控作用,同时自噬能够影响T细胞介导的免疫和自身免疫,对维持T淋巴细胞稳态有重要作用。狼疮患者及小鼠血、肾组织中均表现出异常自噬。另一种非典型自噬,LC3相关性吞噬作用（LAP）是降解和清除凋亡或坏死细胞的一个重要途径。研究发现LAP缺陷的小鼠出现抗ds-DNA、ANA抗体水平升高,肾脏免疫复合物沉积,免疫功能紊乱,提示自身抗体清除异常可能是狼疮加重的重要原因之一。与此同时,T细胞功能异常在LN发病中起到举足轻重的作用,尤其Th17/Treg平衡在近年来引起广泛关注。PI3K/AKT/mTOR信号通路参与了T细胞分化及自身免疫病的进展。目前认为SLE的发生是遗传与环境因素共同作用的结果。在遗传背景相对稳定的前提下,SLE发病率仍逐年升高,提示环境因素在发生发展中的作用不容忽视。因此,越来越多的研究关注环境因素通过表观遗传修饰或引起免疫细胞功能异常在疾病发生发展中的作用。研究发现环境污染物暴露加重人及动物肾脏结构和病理损害。双酚A（BPA）是环境中普遍存在的内分泌干扰物,可以模拟雌激素的作用,是生产各种塑料、罐头内衬容器制品的主要原料,人体的血液、尿液、乳汁均能检测出不同浓度的BPA。研究发现BPA暴露能够加重人尿微量白蛋白水平,加重尿蛋白与肌酐比值,甚至与慢性肾功能不全分期密切相关,而对于免疫功能紊乱个体的肾损伤风险及机制不明确,有待进一步研究。基于对BPA的免疫毒性研究仍处于起步阶段,特别是对于SLE患者,日常接触的BPA是否影响其病情进展缺少研究报道。本研究应用MRL/lpr小鼠模型,首先明确BPA是否加重LN,然后从炎症、抗氧化、自噬角度分析BPA对于LN肾组织的影响,此外从免疫细胞角度探讨BPA对LN小鼠Th17/Treg平衡的影响,PI3K/AKT/mTOR信号通路在BPA暴露加重Th17/Treg失衡在LN发生发展中的可能机制。本研究为进一步探寻LN发生发展的原因及机制提供新思路;也为指导狼疮及免疫功能异常的患者在日常生活避免环境雌激素暴露,同时为修订正常机体和免疫功能异常机体的BPA最低无作用剂量提供科学依据。研究方法:第一部分:18只雌性7周龄MRL/lpr小鼠随机分为3组:对照组（饮用含1%无水乙醇的蒸馏水溶液,n=6）;低剂量组（0.1μg/mL BPA溶液,n=6）;高剂量组（0.2μg/mL BPA溶液,n=6）。12只雌性7周龄C57BL/6小鼠随机分为2组:对照组（饮用含1%无水乙醇的蒸馏水溶液,n=6）;高剂量组（0.2μg/mL BPA溶液,n=6）。实验期间小鼠可自由饮水摄食,染毒时间共计6周。每日测量剩余水容积,以计算饮水量;每周称量小鼠体重,每周称量加入及剩余食物量。自染毒二周后,每周采集各组实验小鼠的尿液标本一次,检测尿蛋白与肌酐比值。实验结束后,测量小鼠脾脏、胸腺、肾脏大小及重量;收集小鼠的血清标本,ELISA法检测抗dsDNA抗体浓度;收集小鼠肾脏标本,进行HE病理染色及肾小球肾炎活动性指数评分,通过免疫组化染色观察MRL/lpr小鼠肾小球IgG、C3沉积情况。第二部分:实验结束后收集小鼠肾脏标本,蛋白印迹法（Western Blot）测定各组小鼠肾组织炎症相关因子NF-κB蛋白,抗氧化因子Nrf2蛋白,m TOR蛋白,自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、P62,LAP相关蛋白Rubicon,受体蛋白ERα、AhR、TLR4表达水平。第三部分:新鲜脾脏标本经研磨过滤后制备成脾细胞悬液,应用FITC-CD4、PE-CD25和Alexa Fluor?647-Foxp3抗体染色后流式细胞分析法检测Treg细胞;上述细胞悬液经过6小时刺激培养后,应用FITC-CD4、PE-IL17A抗体染色后流式法检测Th17细胞。提取小鼠脾脏蛋白,Western Blot测定转录因子蛋白RORγt、Foxp3,mTOR信号通路相关蛋白PI3K、p-PI3K、p-AKT、mTOR、p-mTOR,自噬相关蛋白ULK、Rubicon、P62、Beclin-1、LC3,受体蛋白ERα、AhR、TLR4表达水平。研究结果:第一部分:1.BPA暴露对MRL/lpr和C57小鼠体重、摄食量、饮水量、脏器系数无明显影响。2.0.2μg/mL BPA暴露增加MRL/lpr小鼠血清抗ds-DNA抗体水平,对C57小鼠无明显影响。3.0.2μg/mL BPA暴露升高MRL/lpr小鼠尿蛋白/肌酐比值,对C57小鼠无明显影响。4.未暴露的MRL/lpr组,肾脏HE病理表现以系膜细胞增生为主,间质炎性细胞浸润;MRL/lpr+0.1μg/mL BPA组,表现为毛细血管内细胞增多,间质炎性细胞浸润增多,微血栓形成,部分肾小球局灶硬化;MRL/lpr+0.2μg/mL BPA组,表现为毛细血管内细胞增多,可见多量新月体形成,间质多量炎性细胞浸润,部分肾小球硬化,肾小管上皮细胞肿大,内可见尿蛋白管型。同时,高剂量BPA（0.2μg/mL）组肾小球肾炎活动性指数评分明显高于对照组。而BPA暴露对C57小鼠肾脏HE染色的病理表现无明显改变。5.0.2μg/mL BPA暴露加重MRL/lpr小鼠肾脏免疫球蛋白IgG的沉积,三组MRL/lpr小鼠均表现出补体C3沉积,各组间无明显统计学差异。第二部分:1.0.2μg/mL BPA暴露增加MRL/lpr和C57小鼠肾脏NF-κB的表达。0.2μg/mL BPA暴露增加C57小鼠肾组织中Nrf2表达,而MRL/lpr小鼠暴露0.2μg/mL BPA后肾组织中Nrf2蛋白表达水平明显降低。2.与MRL/lpr对照组相比,BPA暴露降低了肾组织中mTOR、Rubicon的表达,呈剂量-效应关系,0.2μg/mL BPA暴露增加肾组织中LC3蛋白的表达,BPA暴露对Beclin-1、P62无明显影响。与C57对照组相比,0.2μg/mL BPA暴露增加小鼠肾组织中LC3和Rubicon蛋白表达,对mTOR、Beclin-1、P62无明显影响。3.在MRL/lpr小鼠中,0.2μg/mL BPA暴露明显增加肾组织中ERα和AhR蛋白表达水平,对TLR4蛋白表达水平无影响。而在C57小鼠肾组织中,0.2μg/mL BPA暴露明显增加AhR蛋白的表达,而ERα、TLR4蛋白表达水平无明显。第三部分:1.BPA暴露增加MRL/lpr小鼠Th17细胞比例和其转录因子蛋白RORγt的表达,对Treg细胞比例和Foxp3蛋白表达无明显影响。2.与MRL/lpr对照组比较,低剂量BPA（0.1μg/mL）组小鼠脾细胞中的PI3K、p-PI3K、p-AKT（Ser473）、p-AKT（T308）、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达水平均明显上升;高剂量BPA（0.2μg/mL）组小鼠脾细胞中的p-PI3K、p-AKT（Ser473）、p-AKT（T308）、p-mTOR蛋白相对表达水平均明显上升。与C57小鼠对照组相比,0.2μg/mL BPA明显增加了p-PI3K蛋白表达水平。3.与MRL/lpr对照组比较,低剂量BPA（0.1μg/mL）组小鼠脾细胞中的ULK、Rubicon、P62、Beclin-1蛋白相对表达水平均明显上升;高剂量BPA（0.2μg/mL）组小鼠脾细胞中ULK、Beclin-1、LC3蛋白相对表达水平明显上升。与C57小鼠对照组相比,0.2μg/mL BPA使Rubicon、P62、Beclin-1蛋白表达水平明显升高。4.0.2μg/ml BPA暴露增加MRL/lpr小鼠脾组织中ERα、AhR蛋白表达水平,增加C57小鼠脾组织中AhR蛋白的表达。研究结论:1.BPA暴露加重MRL/lpr小鼠狼疮肾炎的疾病活动程度,加重肾组织病理损伤及免疫复合物IgG的沉积。2.BPA暴露增加MRL/lpr小鼠肾组织NF-κB蛋白表达水平,增加炎症反应,加重LN;同时下调mTOR蛋白,并激活自噬,然而这种自噬缺乏Beclin-1的调控和P62参与的降解作用。BPA能够下调MRL/lpr小鼠肾组织中Nrf2和Rubicon蛋白的表达,削弱狼疮小鼠的抗氧化能力和对异常物质的清除作用,这可能是LN肾炎加重的原因之一。BPA能够通过ERα、AhR双途径在MRL/lpr小鼠肾组织中发挥毒性作用。3.BPA暴露增加MRL/lpr小鼠脾组织中Th17细胞比例及RORγt的表达,引起Th17/Treg失衡。BPA暴露上调了MRL/lpr小鼠脾组织PI3K/AKT/mTOR信号通路,激活自噬相关蛋白。BPA能够通过ERα、AhR多途径在MRL/lpr小鼠脾组织中发挥毒性作用。