【摘 要】
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目的:对G6PD缺乏症高发地区云南省德宏州傣族、景颇族、德昂族、阿昌族的G6PD基因突变检出率及突变类型进行调查,为了解该地G6PD基因突变分布规律提供参考。筛选致病性未明的可疑致病突变位点,以致病性明确的c.1388G＞A、c.406C＞T和c.487G＞A突变作为阳性对照,并通过携带者来源的淋巴细胞和基因编辑293T细胞模型验证可疑突变位点的功能影响,为扩充G6PD基因突变谱提供数据支撑。方法
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目的:对G6PD缺乏症高发地区云南省德宏州傣族、景颇族、德昂族、阿昌族的G6PD基因突变检出率及突变类型进行调查,为了解该地G6PD基因突变分布规律提供参考。筛选致病性未明的可疑致病突变位点,以致病性明确的c.1388G＞A、c.406C＞T和c.487G＞A突变作为阳性对照,并通过携带者来源的淋巴细胞和基因编辑293T细胞模型验证可疑突变位点的功能影响,为扩充G6PD基因突变谱提供数据支撑。方法:（1）对收集到的4个民族242例样本行全外显子组测序分析,根据测序注释结果筛选出G6PD基因上的突变位点,统计云南省德宏地区少数民族人群中G6PD基因突变类型分布情况。（2）根据突变统计结果,统计并筛选该地区部分致病性未明的罕见突变位点,结合生物信息学分析其突变频率、致病性及突变对G6PD蛋白结构稳定性的影响。（3）结合预测结果筛选出可疑致病突变位点,选取c.1388G＞A突变男性携带者及c.406C＞T突变女性杂合携带者作为阳性对照,并利用WST-8法检测突变携带者来源的淋巴细胞的G6PD酶活性,RT-qPCR及Western blot检测G6PD基因mRNA及蛋白的相对表达量。（4）利用ABE及PE单碱基编辑系统构建G6PD基因突变293T细胞株,c.406C＞T和c.487G＞A突变作为阳性对照,检测突变细胞株酶活性的变化,利用CCK8法检测突变对293T细胞增殖的影响,利用RT-qPCR、Western blot检测突变对G6PD基因表达的影响,结晶紫染色检测梯度浓度伯氨喹啉处理的突变细胞株对氧化性药物的耐受能力。结果:（1）对德宏地区四个民族G6PD基因突变的筛查结果显示G6PD基因变异检出率为63.64%,携带致病突变位点的检出率为12.40%,在该地区共发现39种不同的基因突变类型,其中单点突变18种,复合突变21种。c.487G＞A突变是德宏地区常见的突变类型,*357A＞G、VIS11-nt93T＞C、c.1311C＞T三个位点复合检出率高达 45%。（2）经分析,c.519C＞T（p.Phe173=）、c.1398C＞T（p.Thr466=）和c.475A＞G（p.Met159Val）三个位点未见报道,其中 c.519C＞T（p.Phe173=）和c.1398C＞T（p.Thr466=）为同义突变,Clinvar数据库中显示其为良性（benign）位点,故排除致病性的可能。而c.475A＞G（p.Met159Val）位点属于错义突变,在gnomADexomeALL数据库中的频率为:0.00001121,其他数据库中未见记录。Provean、Poluphen2、LRT、MutationTaster、FATHMM、GERP++RS 等软件预测结果显示该突变位点高度保守且有害。Imutant2.0、AUTO-MUTE及UCSF Chimera软件预测结果显示突变可导致蛋白结构稳定性降低,Met突变为Val可导致氨基酸残基的侧链发生改变。故推测c.475A＞G突变可能具有致病性,但其功能有待进一步实验验证。（3）淋巴细胞功能检测实验结果显示与野生型细胞相比,阳性对照c.1388G＞A纯合突变可导致G6PD酶活性降低,阳性对照c.406C＞T杂合突变细胞株及c.475A＞G杂合突变细胞株酶活性未改变,三个突变位点均不影响G6PD的表达水平。（4）单克隆细胞Sanger测序显示利用ABE及PE编辑器成功构建c.406C＞T、c.487G＞A、c.475A＞G 293T纯合突变细胞株,酶活性检测结果显示阳性对照c.406C＞T、c.487G＞A突变导致G6PD酶活性下降,c.475A＞G突变未导致酶活性下降。CCK8结果显示突变未对细胞增殖产生影响,RT-qPCR及Western blot检测结果显示c.487G＞A突变细胞株表达水平降低,c.406C＞T及c.475A＞G突变不影响G6PD的表达水平。伯氨喹啉耐受性评估结果提示c.475A＞G突变不影响293T细胞的抗氧化能力,c.406C＞T、c.487G＞A突变对伯氨喹啉耐受能力明显下降。结论:（1）云南省德宏地区傣族、景颇族、德昂族、阿昌族人群的G6PD基因突变检出率为63.64%,致病突变位点检出率为12.4%,c.487G＞A突变是该地区的常见突变类型。（2）结合淋巴细胞及293T细胞模型功能学初探研究显示c.475A＞G突变属于良性多态位点,不具有致病性。
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