一、研究背景传统观念认为高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)是冠状动脉粥样硬化心脏病(冠心病)的保护因素,因此HDL-C成为降低心血管事件风险的研究热点。目前临床及相关研究,尤其是药物临床试验,大多以血浆HDL-C水平作为研究对象和评价指标,然而单纯血浆HDL-C水平难以反应其胆固醇的逆转运、抗炎、抗氧化、保护内皮细胞、抑制血栓形成等多效性功能。HDL-C组成具有明显的异质性,其中蛋白质成分是其多效性功能的主要承担者,如载脂蛋白A (apoA-I)是胆固醇逆转运功能的主体,抗氧化功能主要与对氧磷酶(PON-1)活性有关等。因此,有必要对HDL中发挥重要生物学功能的蛋白质组分进行研究。研究报道,炎性状态下HDL蛋白组成显著改变,促炎蛋白如血清淀粉酶A (SAA)、补体C3等含量明显升高,使HDL丧失保护功能向促动脉粥样硬化方向发展。既往研究证实,冠心病患者HDL的逆转运功能受损、抗炎能力降低。而冠心病状态下HDL蛋白质组分变化研究尚少,而且蛋白质组学的研究方法不同、结果差异较大,较大样本量研究更少。本实验室前期应用蛋白质组学iTRAQ技术筛选出冠心病组与非冠心病组HDL中13种差异表达蛋白。由于蛋白质组iTRAQ技术是基于小样本量(n=10/组)的相对定量技术,所以有必要选取代表性的HDL蛋白组分在较大样本中进一步研究。故本研究分别选取与载脂蛋白、炎症、及免疫系统补体相关的三个蛋白：载脂蛋白C-I(apoC-I)、SAA和补体C5,在稳定冠心病(SCAD)组、急性冠脉综合症(ACS)组和非冠心病(对照组)间进行定量研究,分析三组间HDL蛋白组分差异,为HDL功能改变提供依据,并探讨差异蛋白与冠心病的关系。我们既往研究提示,冠心病患者血浆及其HDL中SAA均显著升高,并与冠心病风险独立相关。其它研究也证实,血浆SAA与动脉粥样硬化(AS)发生发展相关,可增加急性心血管事件。然而血浆SAA水平检测易受感染、创伤等多种因素影响,因此SAA基因检测预测AS及心血管事件风险有一定的临床应用价值。SAA主要由SAA1和SAA2基因编码,国外研究显示SAA基因突变可影响血浆HDL-C、SAA水平,而SAA基因多态性与AS相关性研究较少,且结果差异较大,国内人群SAA基因多态性相关研究更少。颈动脉内膜中层厚度(IMT)增厚是动脉粥样硬化的早期征象,可作为相关心血管事件的预测指标。本研究拟在中国汉族人群中观察SAA1和SAA2基因多态性的分布情况,分析对血浆HDL-C水平及SAA水平的影响,进一步探讨分别与颈动脉IMT和冠心病的相关性,为临床应用SAA基因检测预测动脉粥样硬化及心血管事件风险提供依据。二、研究内容及结果第一部分冠心病患者血浆HDL组分中apoC-I, SAA水平变化研究1.研究目的1.1定量检测SCAD组,ACS组和对照组三组血浆HDL中apoC-I、SAA和补体C5三种HDL蛋白组分的表达差异；1.2定量检测SCAD组,ACS组和对照组三组血浆中apoC-I、SAA水平差异,与血浆HDL中的浓度进行相关性分析。2.研究方法2.1研究对象本研究人群为2011年7月至2012年7月间在阜外心血管病医院就诊的300例未服用调脂药物患者,其中SCAD组65例,ACS组115例,对照组120例；其中SCAD和ACS诊断,均基于冠脉造影证实至少一支冠状动脉狭窄大于50%。2.2实验室检测2.2.1血标本收集及HDL提取：采集空腹静脉血,EDTA抗凝；超高速离心法提取血浆中HDL,65000r/min,5小时20min；2.2.2ELISA方法检测：血浆HDL中apoC-I、SAA和补体C5水平；及血浆中apoC-I和SAA水平。3.研究结果3.1血浆HDL中apoC-I、SAA和补体C5水平差异3.1.1HDL-apoC-I:ACS组(36.08±9.96μg/mL)和SCAD (37.4±10.33μg/mL)组均显著低于对照组(45.18±7.42μg/mL,P均<0.001),多元线性回归校正混杂因素后差异仍存在(F=6.63,P<0.001)；ACS组较SCAD组虽然略下降,但两组间差异无统计学意义(P>0.05)；3.1.2HDL-SAA:三组间log(HDL-SAA)存在显著统计学差异,ACS组(1.53±0.60)和SCAD组(1.32±0.43)显著高于对照组(1.16±0.38,P均<0.001),且ACS组显著高于SCAD组(P<0.01)；多元线性回归校正混杂因素后,三组间log (HDL-SAA)仍存在差异(F=18.58,P<0.001)；3.1.3HDL-C5:ACS组,SCAD组和对照组三组间HDL-C5水平无统计学差异(2.44±0.65ng/mL vs.2.38±0.59ng/mL vs.2.46±0.69ng/mL P=0.872)。3.2血浆中apoC-I和SAA水平变化3.2.1Plasma-apoC-I:ACS组(22.62±13.86μg/mL)和SCAD组(24.10±12.48μg/mL)均显著高于对照组(19.37±6.3μg/mL, P=0.028),但SCAD组和ACS组间无统计学差异(P>0.05)；经Pearson双变量相关性分析显示Plasma-apoC-I与HDL-apoC-I无统计学相关性(P=0.608);3.2.2Plasma-SAA:三组间Log(Plasma-SAA)存在显著统计学差异,ACS组(1.08±063)和SCAD组(0.89±0.50)均显著高于对照组(0.72±0.41,P<0.001),且ACS组显著高于SCAD组(P<0.001),三组间Plasma-SAA变化趋势与HDL-SAA一致；经Pearson相关性分析显示,Plasma-SAA与HDL-SAA强相关(r=0.80,P<0.001)。3.3多因素Logistic回归分析血浆及其HDL中HDL-apoC-I和Plasma-apoC-I与冠心病相关性3.3.1HDL-apoC-I和Plasma-apoC-I与冠心病风险的相关性：校正可能的混杂因素后,HDL-apoC-I与冠心病独立负相关(OR:0.91,95%CI:0.87-0.94, P<0.001), HDL中apoC-I水平降低可能与冠心病发生风险相关；Plasma-apoC-I亦与冠心病独立相关(OR:1.07,95%CI:1.01～1.14,P=0.017),然而,血浆中apoC-I水平升高可能与冠心病发生风险相关；3.3.2HDL-SAA和Plasma-SAA与冠心病风险的相关性：校正可能的混杂因素后,HDL-SAA与冠心病独立相关(OR:5.60,95%CI:2.26～13.84, P<0.001), HDL中SAA水平升高可能与冠心病发生风险相关；Plasma-SAA亦与冠心病独立相关(OR:2.39,95%CI:1.30-4.41, P=0.005),血浆SAA水平升高可能与冠心病发生风险相关；HDL-SAA对冠心病风险的预测价值明显高于Plasma-SAA。4.小结4.1冠心病状态下,HDL蛋白组分发生了改变,炎性蛋白SAA显著升高,尤其ACS患者升高显著,载脂蛋白apoC-I显著降低。4.2HDL-apoC-I和Plasma-apoC-I对冠心病风险的预测方向相反,HDL中apoC-I和血浆中apoC-I可能分别发挥不同的作用。4.3Plasma-SAA与HDL-SAA在冠心病患者中变化趋势一致,且两者强相关,血浆中SAA水平变化或可推测HDL抗炎功能的变化,作为冠心病的预测指标及治疗靶点。第二部分SAA基因多态性与动脉粥样硬化相关性研究1.研究目的1.1观察SAA1(rs11603089)和SAA2(rs1520887, rs2468844, rs7130337, rs7113375)基因多态性位点在中国汉族人群的分布情况；1.2分析SAA1/SAA2基因多态性对血浆HDL-C水平的影响；1.3分析SAA1/SAA2基因多态性分别对血浆及其HDL中SAA水平(Plasma-SAA和IDL-SAA)的影响;1.4研究SAA1/SAA2基因多态性与颈动脉IMT的相关;1.5探讨SAA1/SAA2基因多态性与冠心病的相关性。2.研究方法2.1研究对象本研究人群为2011年7月至2012年7月间在阜外心血管病医院门诊就诊或住院治疗的患者共661例,均为中国汉族人群。其中冠心病患者358例(经冠脉造影证实至少一支冠状动脉狭窄大于5096),非冠心病患者303例。2.2实验室检查2.2.1血浆HDL-C水平测定：所有入组患者(n=661例)均进行血浆HDL-C水平测定,采用美国BECKMAN DxC800全自动生化分析仪进行；2.2.2HDL提取及ELISA方法检测SAA.入选人群中有282例患者进行血浆及其HDL中SAA水平检测；超高速离心法提取血浆中HDL; ELISA方法检测血浆及其HDL中SAA水平(Plasma-SAA和HDL-SAA);2.2.3基因多态性检测：采用MGB-Taqman探针法,ABI7500荧光定量PCR仪对SAAl (rs11603089)和SAA2(rs1520887, rs2468844, rs7130337,rs7113375)进行基因分型检测。2.3颈动脉内膜中层厚度(IMT)测量：入选人群中有298例患者进行了颈动脉超声检查,采用SIEMENS ACUSON Sequoia512彩色多普勒超声诊断仪,双侧颈总动脉IMT均值为最终的颈动脉IMT。3.研究结果3.1基因分型：在中国汉族人群中,SAAl rs11603089突变等位基因的发生频率为25.3%;SAA2四个位点rs1520887, rs2468844, rs7130337和rs7113375的突变等位基因的发生频率分别为32.5%,3.0%,28.0%和3.9%；除rs7130337外,其它基因突变位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.005),均可反映中国汉族人群基因频率分布特征,故不再对rs7130337进一步研究。3.2SAA1/SAA2基因多态性对血浆HDL-C水平的影响3.2.1SAA2-rs1520887位点：野生组(n=299)血浆HDL-C水平显著高于突变组(n=247),差异有统计学意义(1.15±0.32mmol/L vs.1.09±0.29mmol/L, P=0.033),但多元线性回归分析校正可能的混杂因素后,血浆HDL-C水平与SAA2-rs1520887基因突变相关性消失(P>0.05)；3.2.2SAA2-rs7113375位点：野生组(n=501)血浆HDL-C水平显著高于突变组(n=45),差异有统计学意义(1.14±0.31mmol/L vs.1.00±0.24mmol/L, P=0.004),多元性行回归校正可能的混杂因素后,血浆HDL-C水平与rs7113375(β=0.12, P=0.003)独立相关；3.2.3SAA1-ts11603089和SAA2-rs2468844位点：该两个位点的野生组和突变组组间血浆HDL-C水平均无统计学差异(P>0.05)。3.3SAA1/SAA2基因多态性对血浆中SAA水平(Plasma-SAA)的影响3.3.1SAA2-rs2468844位点：野生基因组(n=265) log (Plasma-SAA)低于突变基因组(n=17),差异有统计学意义(0.81±0.54vs1.14±0.51,P=0.017)；多元线性回归模型校正可能的混杂因素显示,log (Plasma-SAA)与SAA2-rs246S844基因多态性独立相关(标准化p=0.12,P=0.028)；3.3.2SAA2-rs7113375位点：野生基因组(n=263) log (Plasma-SAA)显著低于突变组(n=19),差异有统计学意义(0.81±0.53vs.1.14±0.61, P=0.012);多元线性回归模型校正可能的混杂因素显示,log (Plasma-SAA)与SAA2-rs7113375基因多态性独立相关(标准化p=0.20,P<0.001)；3.3.3其它2个位点SAA1-rs11603089和SAA2-rs1520887的野生组和突变组间log (Plasma-SAA)均无统计学差异(P>0.05)3.4SAA1/SAA2基因多态性对血浆HDL中SAA (HDL-SAA)的影响3.4.1SAA2-rs7113375位点：野生基因组(n=263) log (HDL-SAA)显著低于突变组(n=19),差异有统计学意义(1.29±0.54vs.1.59±0.57, P=0.018);多元线性回归模型校正可能的混杂因素显示,log (HDL-SAA)与SAA2-rs7113375基因多态性独立相关(标准化p=0.18,P<0.001)。3.4.2其它3个基因位点SAA1-rsl1603089,SAA2-rs1520887, SAA2-rs2468844的野生组和突变组间log (HDL-SAA)均无统计学差异(P>0.05)。3.5SAA1/SAA2基因多态性与颈动脉IMT相关性3.5.1SAA2-rs7113375位点：野生基因组(n=247)颈动脉IMT低于突变基因组(n=51),差异有统计学意义(0.86±0.21vs.1.03±0.28,P<0.001),多元线性回归模型分析,校正可能的影响因素后rs7113375基因多态性与颈动脉IMT独立相关(标准化p=-0.24,P<0.001)；3.5.2其它3个基因多态性位点SAA1-rs11603089,SAA2-rs1520887, SAA2-rs2468844的野生基因组和突变基因组组间颈动脉IMT均无差异(P>0.05)。3.6SAA1/SAA2基因多态性与冠心病的相关性：冠心病组(n=358)和对照组(n=303)组间SAA1/SAA2基因多态性分布统计学分析显示,两组间各基因多态性位点(rs11603089, rs1520887, rs2468844,和rs7113375)的基因型分布均无统计学差异(P>0.05)；将冠心病作为因变量,SAAl及SAA2基因多态性分别作为协变量单因素logistic回归分析,结果显示各位点rs11603089, rs1520887, rs2468844, rs7113375基因多态性与冠心病无相关性(P>0.05)。4.小结4.1本研究人群中(n=661),SAA1-rs11603089, SAA2-rs1520887, SAA2-rs2468844和SAA2-rs7113375均符合Hardy-Weinberg平衡,可反映中国汉族人群基因频率分布特征,其中SAA1-rs11603089和SAA2-rs1520887为常见突变。4.2SAA2-rs7113375基因多态性与血浆HDL-C水平独立相关,突变基因携带者血浆HDL-C水平较低。4.3SAA2-rs2468844基因多态性与Plasma-SAA水平独立相关,突变基因携带者Plasma-SAA水平较高；SAA2-rs7113375基因多态性与Plasma-SAA及HDL-SAA水平均独立相关,突变基因携带者Plasma-SAA及HDL-SAA水平均升高。4.4SAA2-rs7113375基因多态性与颈动脉IMT独立相关,突变基因携带者颈动脉IMT增厚。4.5SAA1/SAA2基因多态性与冠心病无相关性。三、结论1.冠心病状态下,HDL蛋白组分发生了改变,炎性蛋白SAA显著升高,载脂蛋白apoC-I显著降低,为其抗炎能力下降、逆转运功能受损提供依据,HDL特定蛋白组分的检测可能较单纯血浆HDL-C水平测定更具应用价值。2. Plasma-SAA与HDL-SAA在冠心病患者中变化趋势一致,且两者强相关,血浆中SAA水平变化或可推测HDL抗炎功能变化,可作为冠心病的预测指标及治疗靶点。3.SAA2基因多态性与颈动脉IMT独立相关,rs7113375位点基因突变组颈动脉IMT增厚,rs7113375基因检测或可预测动脉粥样硬化及其相关心血管事件风险。4. SAA2-rs7113375基因多态性与Plasma-SAA及HDL-SAA均独立相关,突变基因携带者Plasma-SAA及HDL-SAA水平均较高,为该基因突变参与动脉粥样硬化提供依据。