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研究背景:肠道病毒(enterovirus,EV)属于小RNA病毒目小RNA病毒科中肠道病毒属。EV目前包含12个组:EV-A至EV-H,EV-J以及鼻病毒A～C组。目前EV-A包含了 25种血清型别的病毒:柯萨奇A组病毒(Coxsackievirus A,CV-A)2-8,10,12,14和16;EV-A71,A76,A89-92,A114 和 A119-121;猴肠道病毒(Simian enterovirus,SV)19,43和46以及狒狒肠道病毒(baboon enterovirus)A13。手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)是一类易感染儿童的常见传染性疾病。90%以上的HFMD病例都是由EV-A引起的,监测数据显示,引起我国2008～2012年HFMD的主要病原体为EV-A71和CV-A16,两种病原体交替流行。但是2013年以来不断报道由CV-A6引起的大规模HFMD暴发,在某些省市,CV-A6甚至已经超过EV-A71和CV-A16成为导致HFMD的主要病原体,对我国的公共卫生起到不容小视的影响。CV-A6在我国的流行有以下两个重要特点,一是同一地区反复发生较大规模HFMD暴发,二是出现较多重症HFMD患儿,形成这样的疾病流行特点的原因是科学家们试图解决的问题之一。目前我国的研究主要集中在部分省市暴发时的研究,地理分布较窄且时间跨度较小,但是尚未有对全国CV-A6大规模暴发的传播模式、遗传进化规律及其致病力的系统研究。CV-A6变异往往也导致其致病力、流行特性和临床表现等发生改变,从而给HFMD临床诊断、治疗、疫苗研发和预防控制带来一定的困难,因此如何应对CV-A6变异是HFMD防控面临的巨大挑战之一。研究目的:阐明我国CV-A6的流行规律,系统地掌握其进化和流行情况,完善对其基因特点、基因分型、传播模式和遗传进化规律的认识,试图分析CV-A6与重症HFMD的关系,从多个角度揭示我国CV-A6在近五年中成为主要HFMD病原体的原因,揭示其公共卫生意义。研究方法:对中国近几年分离的有代表性的520株CV-A6进行全长VP1编码区核苷酸进行测序,同时收集筛选GenBank数据库上340条国内外CV-A6 VP1编码区全长序列,对860条CV-A6 VP1区序列构建CV-A6数据集;对25株代表毒株进行全基因组测序,同时收集筛选GenBank数据库上中国CV-A6基因组全长序列25株,对50株国内CV-A6全长基因组序列一并进行分析。使用基于贝叶斯原理的蒙特卡罗-马尔科夫链方法(Markov Chain Monte Carlo,MCMC)等国际上最新的用生物信息学研究方法,对其基因序列,变异变迁,重组情况和进化规律等特征进行系统分析,初步探讨CV-A6与重症HFMD的关系。研究结果:1.对世界范围内CV-A6进行亲缘性关系分析,并进行系统的基因型、基因亚型的划分(基于全长VP1区核苷酸序列),按照肠道病毒基因型和基因亚型划分原则,CV-A6一共可以划分为四个基因型:A～D。B～D基因型可以进一步划分为B1～B2,C1～C2,以及D1～D3基因亚型。国际近期流行的CV-A6大多集中在D3亚型。2.将中国大陆807株及非中国大陆52株共860株CV-A6全长VP1区核苷酸序列构建系统发生树,可见我国大陆流行的CV-A6为D2,D3基因亚型,2008年及以前我国CV-A6优势基因亚型可能为D2亚型,2009～2013年出现D2和D3基因型的更替,D3亚型CV-A6逐渐增多,成为我国流行的CV-A6绝对优势基因亚型。D3亚型又可进一步分为D3a,D3b两个进化分支,我国绝大多数CV-A6,尤其暴发时期的CV-A6都集中在D3a进化分支上,而D3b进化分支CV-A6可能只是短时间内小范围的流行。3.运用贝叶斯MCMC方法对124株世界范围内CV-A6以及我国106株D2,D3亚型CV-A6的VP1区全长核苷酸序列进行起源和进化分析,提示我国CV-A6核苷酸代替速率比世界慢,D2、D3基因亚型共同祖先可追溯到1996年左右。对我国CV-A6进行种群动态变化分析,得出D3基因亚型CV-A6在2013年种群明显扩增,与流行病学资料相符。4.对中国流行的50株CV-A6进行全基因组序列分析,提示我国流行的CV-A6至少存在6种重组模式,D2亚型有两种,D3亚型有四种,其中D3亚型的三种重组模式CV-A6可确定供体信息,均有极大可能性与近几年国内流行的其它EV-A之间发生重组。5.对随机挑选的14株重症(死亡)HFMD及19株轻症HFMD的2C及3D编码区全长序列进一步加以分析,提示在3D区与近几年流行的其它EV-A发生重组的CV-A6可能导致重症HFMD的几率更高。6.结合CV-A6感染引起的HFMD患儿的临床表现,对CV-A6的VP1、2C及3D编码区的氨基酸突变进行统计学分析,结果发现,一些氨基酸性质的改变可能与CV-A6的毒力和传播力有关。研究结论:1.目前世界范围内所有流行的CV-A6均属于D基因型,中国大陆流行的CV-A6属于D2及D3亚型,且2013年开始陆续暴发的CV-A6绝大部分均属于D3基因亚型的D3a进化分支。2.我国大陆的CV-A6流行经历三个阶段。第一阶段:2008年及以前流行的CV-A6以D2基因亚型为优势基因亚型;第二阶段:2009～2013年,D2与D3基因亚型共同流行,且D3为优势基因亚型,出现D2和D3基因亚型的更替;第三阶段:2013年及以后流行的CV-A6,D2基因亚型几乎消失,D3基因亚型尤其是D3a进化分支毒株成为引起大规模暴发的CV-A6的绝对优势基因亚型。3.中国D2及D3基因亚型CV-A6核苷酸进化速率较快,D2亚型比D3亚型快,且中国CV-A6的核苷酸代替速率较世界其它国家CV-A6慢。4.中国近几年流行的CV-A6大致存在6种重组模式,部分重组模式株与近几年流行的其它EV-A在非结构蛋白编码区发生重组,并对其毒力有一定影响,可能更易引发重症 HFMD。5.CV-A6可能在VP1、2C及3D区存在毒力位点,且3D区的第342氨基酸的突变(S→L)和第436位氨基酸的突变(A→T/S),可能与重症HFMD之间有关系。