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漆酶是一类含铜多酚氧化酶,不同种属生物所产生的漆酶性质和功能具有不同,在真菌中漆酶在其生活史中具有降解木质素、抑制真菌生长的酚类物质的脱毒和子实体的形成等作用,但其功能很少有实验证明。本文利用硫酸铵分级沉淀、透析和DEAE-sepharose阴离子交换柱层析对松杉灵芝漆酶进行了纯化并且对其酶学性质进行了测定,同时本文通过对漆酶基因敲除菌株、回补菌株和过量表达菌株在菌丝生长及出菇过程中的生理生化指标的测定,探索漆酶基因在松杉灵芝生长发育过程的功能,主要研究结果如下:1松杉灵芝漆酶的分离纯化及其酶学性质研究松杉灵芝胞外漆酶经分离纯化及酶学性质测定,结果表明,该漆酶分子量约为52 KDa,40℃下纯化后松杉灵芝漆酶对ABTS的米氏常数Km=0.909 mmol/L,最大反应速度Vm=454.5 mmolL-1min-1;其最适反应温度40℃,在4℃下时放置12 h酶活性几乎没有减弱具有良好的稳定性,温度升高时热稳定性变弱;纯化后的漆酶最适pH为4,且在pH为4时具有较高的稳定性,当pH升高时稳定性逐渐降低,而在pH为3的酸性环境中时稳定性相对最弱,放置72 h后几乎丧失全部酶活性;不同金属离子对纯化后的松杉灵芝漆酶活性影响差异明显,K+和Fe3+对纯化后的漆酶具有明显的的激活作用,Fe2+对松杉灵芝漆酶抑制作用明显,甚至可以对松杉灵芝漆酶活性完全抑制。2松杉灵芝漆酶基因回补菌株和漆酶基因过表达菌株的构建本研究构建了含有松杉灵芝漆酶基因cDNA序列的表达载体pTE11-了accase,同时利用实验室保存的含有一色齿毛菌漆酶基因全基因序列的表达载体pPICZα-Laccase分别转化松杉灵芝漆酶基因敲除菌株△Lac-A19和野生型菌株Gps1并成功构建了松杉灵芝漆酶基因回补菌株△Lac-A19/pTE11-Laccase、△Lac-A 19/pPICZα-Laccase 和 过 表 达 菌 株 Gps1/pTE1 1-Laccase、Gps1/pPICZα-Laccase,对以上菌株的漆酶基因转录水平qRT-PCR检测实验结果表明 以上不同菌株间漆酶基因转录水平关系:Gps 1/pPICZα-Laccase>Gps 1/pTE 1 1-Laccase>△ Lac-A 19/pPICZα-Laccase>Gps 1>△ Lac-A 19/pTE 1 1-Laccase>△Lac-A 19;与此同时在对以上菌株产漆酶能力测定结果也表明:漆酶基因过表达菌株及野生型菌株产漆酶能力较高,敲除菌株△Lac-A19在PDA培养基上不能产生漆酶,回补菌株产漆酶能力发生较大程度提升。3漆酶基因对松杉灵芝生长发育影响的研究对以上不同菌株菌丝生长特性研究结果表明,高产漆酶的过表达菌株和出发菌株在PDA培养基上菌丝粗壮致密,生长速度较快,不产漆酶的敲除菌株△Lac-A19菌丝生长速度慢,菌丝稀疏且极易断裂和老化,电镜观察表明高产漆酶菌株菌丝粗壮发达且菌丝末端具有大量细小新生分支。出菇实验结果表明高产漆酶菌株在栽培料中菌丝生长速度较快,木质素降解效率高、生物学效率高、子实体产量高、色泽鲜亮、品质较好,显著优于敲除菌株△Lac-A19。结果表明漆酶在松杉灵芝菌丝生长和子实体的发育过程中具有重要作用。