论文部分内容阅读
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由多种肺内及肺外直接或间接因素导致的一种急性炎症性疾病。这种炎症反应会引起肺部的肺泡毛细血管内膜的损伤加重，导致肺泡毛细血管的渗透性增加，是临床常见的高发病率的疾病，其发病与肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophage，AM）分泌TNF-α等炎性因子，直接激活多形核粒细胞(polymorphonuclear leukocytes，PMNs)，导致肺内部失控性炎症爆发，引发ALI的发生。炎症反应的基本特征是组织酸化，局部组织的pH值轻度下降。巨噬细胞会感受炎症发生区域的pH值下降参与炎症的发生，其表面是否存在对pH下降敏感的蛋白，从而介导各种炎症反应的发生值得我们深入探讨。
酸敏感离子通道1a（acid-sensing ion channels1a，ASIC1a)是一类质子H+门控的酸敏感通道。多种炎症性疾病发生时，组织pH值轻度下降，ASIC1a通道会感知这种pH值的下降，加重炎症反应引起机体损伤。目前研究指出胞外酸化诱导ASIC1a通道激活，调控巨噬细胞的形成及功能，参与多种炎症性疾病的发生。另有研究表明ASIC1a通道激活可以调控脊髓巨噬细胞中炎症因子的表达，但具体机制尚不清楚，有待进一步研究。因此，深入研究ASIC1a在炎症中的作用对炎症性疾病的治疗具有十分重要的意义。
内质网是Ca2+的储存库，当胞外Ca2+内流入细胞内会导致胞内Ca2+超载，导致内质网的蛋白质合成功能及折叠的功能均失调，激活内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。众多研究表明，ERS通过激活NF-κB，MARK等炎症信号通路，参与调节炎症的发生发展。课题组前期研究结果发现：ASIC1a在ALI引发的炎症环境中表达升高，而ERS在ALI的发生发展中发挥重要作用。ASIC1a活化诱导胞外Ca2+内流，细胞内Ca2+稳态改变会诱发ERS。为此，本实验在课题组前期研究基础上，研究体内外炎症模型中ASIC1a对LPS活化巨噬细胞分泌的TNF-α表达的影响及其与ERS之间的关系。主要研究内容概括如下：
1、ALI小鼠模型的肺泡巨噬细胞中ASIC1a及TNF-α的表达变化
本课题建立小鼠ALI模型（尾静脉注射LPS），采用支气管灌洗技术，提取支气管肺泡灌洗液，进一步支气管肺泡灌洗液中分离提取小鼠AM。制成ALI小鼠模型的肺组织切片，HE染色观察ASIC1a对肺组织病理变化的影响，观察ASIC1a对肺组织的湿干重比影响。
结果：显示：ALI小鼠模型成功建立，ASIC1a参与ALI的发生。采用瑞氏-姬萨姆染色对AM进行纯度鉴定，结果显示AM的纯度较高，ALI小鼠AM成功分离及培养。采用Western Blot、q-PCR和ELISA实验方法观察ASIC1a、TNF-α在AM中ASIC1a、TNF-α的表达变化，结果显示，与正常组相比，LPS组AM中ASIC1a、TNF-αm RNA及蛋白表达均显著增加。
结果：提示，ASIC1a参与ALI引发的炎症反应。
2、ALI小鼠模型的AM中，阿米洛利（Amiloride）阻断ASIC1a后，ASIC1a、TNF-α、ERS相关蛋白GRP78、CHOP、C/EBPα的表达变化
实验采用Western Blot、q-PCR和ELISA实验方法观察ASIC1a、TNF-α、ERS相关蛋白GRP78、CHOP、C/EBPα的表达。
结果：显示：LPS组小鼠AM中ASIC1a、GRP78、CHOP、TNF-α表达均明显升高，C/EBPα表达显著下降。提示ASIC1a通过激活ERS参与ALI引发的炎症反应。
3、细胞模型使用LPS的最佳刺激浓度与最佳作用时间的筛选
实验采用测定NO分泌量筛选细胞模型中LPS刺激巨噬细胞的最佳给药浓度及最佳作用时间。
结果：显示：LPS的最佳给药浓度为0.25μg/mL，NO分泌量最高。LPS的最佳作用时间为24h，NO分泌量最高。提示LPS活化RAW264.7细胞最佳给药浓度与最佳作用时间为0.25μg/mL，24h，细胞模型构建成功。
4、LPS活化RAW264.7细胞对ASIC1a及TNF-α表达的影响
LPS(0.25μg/mL)活化RAW264.7细胞，Western Blot、q-PCR和ELISA观察细胞模型中ASIC1a和TNF-α的表达变化。
结果：显示，LPS组ASIC1a和TNF-α的表达均较正常组显著升高（P＜0.01），进一步提示ASIC1a参与LPS活化RAW264.7细胞引发的炎症反应。
5、LPS活化RAW264.7细胞时PcTx1对Ca2+浓度变化的影响
采用激光共聚焦技术动态检测RAW264.7细胞内PcTx1对Ca2+浓度的变化的影响。共聚焦荧光图片和相对的浓度轨迹结果限显示，LPS刺激巨噬细胞，Ca2+荧光强度明显增强，使用PcTx1作用于巨噬细胞后,Ca2+荧光强度明显减弱。提示ASIC1a可以促进Ca2+内流。
6、PcTx1/ASIC1a-ShRNA阻断ASIC1a后，LPS活化RAW264.7时ASIC1a、ERS相关蛋白、TNF-α的表达变化
给予LPS(0.25μg/mL)刺激RAW264.7细胞24h，建立体外细胞炎症模型。使用PcTx1和ASIC1a-ShRNA阻断ASIC1a后。Western Blot、q-PCR、ELISA实验方法观察TNF-α、ERS标记蛋白GRP78、CHOP及C/EBPα的蛋白及mRNA表达变化。结果发现，在PcTx1/ShRNA-ASIC1a处理巨噬细胞后，Western Blot结果显示ERS标记蛋白GRP78、CHOP的表达降低，C/EBPα表达升高。ELISA实验方法观察TNF-α表达变化，结果显示，TNF-α表达显著降低。q-PCR结果与Western Blot、ELISA结果一致。提示ASIC1a通过激活ERS参与调节体外LPS活化RAW264.7细胞中TNF-α的表达。
7、CHOP与C/EBPα的相互作用
采用免疫沉淀实验观察CHOP与C/EBPα的相互作用关系。结果显示，在蛋白质混合溶液中CHOP与C/EBPα存在表达。当沉淀CHOP蛋白时，C/EBPα被沉淀下来。同理，当沉淀C/EBPα蛋白时，CHOP蛋白也被沉淀下来。结果表明，CHOP与C/EBPα在细胞内有相互作用，二者可以发生结合。
8、C/EBPα对TNF-α启动子活性的影响
采用荧光素酶实验观察C/EBPα对TNF-α启动子活性的影响，结果显示：转染m-C/EBPα质粒，与空载体相比较，荧光素酶活性没有变化。转染TNF-α质粒，与空载体相比较，荧光素酶没有变化。当C/EBPα与TNF-α质粒共转染时，荧光素酶活性显著增强，结果提示C/EBPα可以与TNF-α的启动子区域直接结合。
9、过表达C/EBPα在LPS活化RAW264.7细胞中对TNF-α的表达的影响
进一步观察C/EBPα与TNF-α之间的关系，采用过表达C/EBPα质粒转染RAW264.7细胞24h，q-PCR与ELISA实验方法观察TNF-α的表达变化，结果显示过表达C/EBPα，TNF-α的表达显著降低，结果提示C/EBPα在LPS活化的RAW264.7细胞中负调控TNF-α表达。
酸敏感离子通道1a（acid-sensing ion channels1a，ASIC1a)是一类质子H+门控的酸敏感通道。多种炎症性疾病发生时，组织pH值轻度下降，ASIC1a通道会感知这种pH值的下降，加重炎症反应引起机体损伤。目前研究指出胞外酸化诱导ASIC1a通道激活，调控巨噬细胞的形成及功能，参与多种炎症性疾病的发生。另有研究表明ASIC1a通道激活可以调控脊髓巨噬细胞中炎症因子的表达，但具体机制尚不清楚，有待进一步研究。因此，深入研究ASIC1a在炎症中的作用对炎症性疾病的治疗具有十分重要的意义。
内质网是Ca2+的储存库，当胞外Ca2+内流入细胞内会导致胞内Ca2+超载，导致内质网的蛋白质合成功能及折叠的功能均失调，激活内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。众多研究表明，ERS通过激活NF-κB，MARK等炎症信号通路，参与调节炎症的发生发展。课题组前期研究结果发现：ASIC1a在ALI引发的炎症环境中表达升高，而ERS在ALI的发生发展中发挥重要作用。ASIC1a活化诱导胞外Ca2+内流，细胞内Ca2+稳态改变会诱发ERS。为此，本实验在课题组前期研究基础上，研究体内外炎症模型中ASIC1a对LPS活化巨噬细胞分泌的TNF-α表达的影响及其与ERS之间的关系。主要研究内容概括如下：
1、ALI小鼠模型的肺泡巨噬细胞中ASIC1a及TNF-α的表达变化
本课题建立小鼠ALI模型（尾静脉注射LPS），采用支气管灌洗技术，提取支气管肺泡灌洗液，进一步支气管肺泡灌洗液中分离提取小鼠AM。制成ALI小鼠模型的肺组织切片，HE染色观察ASIC1a对肺组织病理变化的影响，观察ASIC1a对肺组织的湿干重比影响。
结果：显示：ALI小鼠模型成功建立，ASIC1a参与ALI的发生。采用瑞氏-姬萨姆染色对AM进行纯度鉴定，结果显示AM的纯度较高，ALI小鼠AM成功分离及培养。采用Western Blot、q-PCR和ELISA实验方法观察ASIC1a、TNF-α在AM中ASIC1a、TNF-α的表达变化，结果显示，与正常组相比，LPS组AM中ASIC1a、TNF-αm RNA及蛋白表达均显著增加。
结果：提示，ASIC1a参与ALI引发的炎症反应。
2、ALI小鼠模型的AM中，阿米洛利（Amiloride）阻断ASIC1a后，ASIC1a、TNF-α、ERS相关蛋白GRP78、CHOP、C/EBPα的表达变化
实验采用Western Blot、q-PCR和ELISA实验方法观察ASIC1a、TNF-α、ERS相关蛋白GRP78、CHOP、C/EBPα的表达。
结果：显示：LPS组小鼠AM中ASIC1a、GRP78、CHOP、TNF-α表达均明显升高，C/EBPα表达显著下降。提示ASIC1a通过激活ERS参与ALI引发的炎症反应。
3、细胞模型使用LPS的最佳刺激浓度与最佳作用时间的筛选
实验采用测定NO分泌量筛选细胞模型中LPS刺激巨噬细胞的最佳给药浓度及最佳作用时间。
结果：显示：LPS的最佳给药浓度为0.25μg/mL，NO分泌量最高。LPS的最佳作用时间为24h，NO分泌量最高。提示LPS活化RAW264.7细胞最佳给药浓度与最佳作用时间为0.25μg/mL，24h，细胞模型构建成功。
4、LPS活化RAW264.7细胞对ASIC1a及TNF-α表达的影响
LPS(0.25μg/mL)活化RAW264.7细胞，Western Blot、q-PCR和ELISA观察细胞模型中ASIC1a和TNF-α的表达变化。
结果：显示，LPS组ASIC1a和TNF-α的表达均较正常组显著升高（P＜0.01），进一步提示ASIC1a参与LPS活化RAW264.7细胞引发的炎症反应。
5、LPS活化RAW264.7细胞时PcTx1对Ca2+浓度变化的影响
采用激光共聚焦技术动态检测RAW264.7细胞内PcTx1对Ca2+浓度的变化的影响。共聚焦荧光图片和相对的浓度轨迹结果限显示，LPS刺激巨噬细胞，Ca2+荧光强度明显增强，使用PcTx1作用于巨噬细胞后,Ca2+荧光强度明显减弱。提示ASIC1a可以促进Ca2+内流。
6、PcTx1/ASIC1a-ShRNA阻断ASIC1a后，LPS活化RAW264.7时ASIC1a、ERS相关蛋白、TNF-α的表达变化
给予LPS(0.25μg/mL)刺激RAW264.7细胞24h，建立体外细胞炎症模型。使用PcTx1和ASIC1a-ShRNA阻断ASIC1a后。Western Blot、q-PCR、ELISA实验方法观察TNF-α、ERS标记蛋白GRP78、CHOP及C/EBPα的蛋白及mRNA表达变化。结果发现，在PcTx1/ShRNA-ASIC1a处理巨噬细胞后，Western Blot结果显示ERS标记蛋白GRP78、CHOP的表达降低，C/EBPα表达升高。ELISA实验方法观察TNF-α表达变化，结果显示，TNF-α表达显著降低。q-PCR结果与Western Blot、ELISA结果一致。提示ASIC1a通过激活ERS参与调节体外LPS活化RAW264.7细胞中TNF-α的表达。
7、CHOP与C/EBPα的相互作用
采用免疫沉淀实验观察CHOP与C/EBPα的相互作用关系。结果显示，在蛋白质混合溶液中CHOP与C/EBPα存在表达。当沉淀CHOP蛋白时，C/EBPα被沉淀下来。同理，当沉淀C/EBPα蛋白时，CHOP蛋白也被沉淀下来。结果表明，CHOP与C/EBPα在细胞内有相互作用，二者可以发生结合。
8、C/EBPα对TNF-α启动子活性的影响
采用荧光素酶实验观察C/EBPα对TNF-α启动子活性的影响，结果显示：转染m-C/EBPα质粒，与空载体相比较，荧光素酶活性没有变化。转染TNF-α质粒，与空载体相比较，荧光素酶没有变化。当C/EBPα与TNF-α质粒共转染时，荧光素酶活性显著增强，结果提示C/EBPα可以与TNF-α的启动子区域直接结合。
9、过表达C/EBPα在LPS活化RAW264.7细胞中对TNF-α的表达的影响
进一步观察C/EBPα与TNF-α之间的关系，采用过表达C/EBPα质粒转染RAW264.7细胞24h，q-PCR与ELISA实验方法观察TNF-α的表达变化，结果显示过表达C/EBPα，TNF-α的表达显著降低，结果提示C/EBPα在LPS活化的RAW264.7细胞中负调控TNF-α表达。