蛋白酶是生命活动必不可少的生物大分子,它能对特定的底物进行高选择性、限制性和有效的加工,从而引发蛋白翻译后水平的不可逆变化,进而影响胚胎发育、神经元生长、细胞周期调控等重要的生物进程。蛋白酶的结构和表达模式的改变是人类许多病理过程的基础,对疾病发病机制的研究具有一定的意义。基于抗原-抗体相互作用的免疫分析法虽然能够灵敏检测蛋白酶的质量浓度,但是蛋白酶前体(酶原)会引起假阳性信号。而基于蛋白酶水解底物多肽的分析方法缺乏有效的信号放大过程,灵敏度尚不能完全满足临床生化分析的要求。因此,发展高效的信号转换放大策略,实现高灵敏的蛋白酶活性分析具有重要的应用价值。本文中,我们以T7溶菌酶-T7 RNA聚合酶融合蛋白为模块,构建了将蛋白酶活性信号转换放大为核酸信号输出的酶切激活转录的元件,并进一步建立蛋白酶生物传感新方法实现对蛋白酶活性的超灵敏分析。具体的工作内容如下:1.蛋白酶酶切激活转录的信号转换放大元件的构建及其用于蛋白酶活性分析的验证。T7溶菌酶(T7 Lysozyme)能抑制T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的转录活性,而目标蛋白酶能劈裂两者的连接肽使T7 RNAP活性恢复从而通过转录产生大量RNA。将输出RNA设计为G-四联体(G4)序列,其与小分子染料结合产生荧光,通过荧光信号的强弱反映蛋白酶活性的强弱。以凝血酶为蛋白酶模型,该方法的检测限为低至0.33 pM,低于现有的检测方法。这一方法不仅能实现蛋白信号到核酸信号的转变,还能利用转录这一核酸信号放大策略提高目标物检测的灵敏度,为蛋白酶的检测提供了一个有利的工具,也为后续的研究奠定了基础。2.基于酶切激活转录的信号转换放大的比色法用于检测肿瘤标志物MMP-2。在研究内容1的基础上,我们将融合蛋白中的连接肽更换为MMP-2特异性底物序列,构建了响应MMP-2活性的酶切激活转录的信号转换放大元件。我们设计输出RNA的序列,使其引起DNA功能化的AuNPs交联聚集产生比色信号,通过AuNPs的颜色和吸收光谱的变化对MMP-2进行定量分析,最终获得的检测限为17 pM。该传感方法不仅灵敏度高,还能实现肉眼观测,具有point of care(POC)检测的潜力。3.基于酶切激活转录的信号转换放大的快速、可视化检测MMP-2的纸基传感器。将研究内容2中的比色反应移至纸基,并通过智能手机进行定量分析,最终获得的MMP-2的检测限为17 pM。该纸基传感器无需大型仪器的辅助,成本更低,操作更便捷。我们进一步将其应用于分析不同细胞中MMP-2的表达水平,取得了较好的区分效果,表明该传感器在临床诊断方面的应用潜力。