【摘 要】
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铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）自从发现以来,一直被认为是一种关键抗氧化酶,催化超氧阴离子（O2·-）歧化成分子氧和过氧化氢（H2O2）,使胞内活性氧（ROS）处于内稳态。尽管近期发现该酶能调控关键的胞内ROS信号转导网络,但与其抗氧化完全不同的功能,即与DNA相互作用调控基因表达的功能却一直没有引起国内外的关注。根据课题组以前的研究和文献报道,我们提出了一个假设:SOD1可能是一种感应胞内活性氧水
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铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）自从发现以来,一直被认为是一种关键抗氧化酶,催化超氧阴离子（O2·-）歧化成分子氧和过氧化氢（H2O2）,使胞内活性氧（ROS）处于内稳态。尽管近期发现该酶能调控关键的胞内ROS信号转导网络,但与其抗氧化完全不同的功能,即与DNA相互作用调控基因表达的功能却一直没有引起国内外的关注。根据课题组以前的研究和文献报道,我们提出了一个假设:SOD1可能是一种感应胞内活性氧水平的基因表达调控蛋白。为了获得支持这一假设的一些证据,这里表达了野生型WT-SOD1、突变体A4V及H46R-H48Q蛋白,应用荧光各向异性等实验方法系统测定不同的氧化还原条件下SOD1与DNA结合的平衡常数,从而证实SOD1是一种能与DNA结合的蛋白质。取得的主要结果如下:1.构建了 WT-SOD1、A4V及H46R-H48Q蛋白的重组质粒并将其导入大肠杆菌进行表达纯化,优化诱导条件并提取大量高活力蛋白;2.WT-SOD1与双链DNA5’-ATGGAATGGAAT-3’的结合可达108 M-1,氧化环境使WT-SOD1与DNA的结合减弱,还原环境下WT-SOD1与DNA的结合变为非特异性结合,SOD 1中活性部位Cu2+被螯合后无法与DNA结合;3.突变体A4V与双链DNA5’-ATGGAATGGAAT-3’序列的结合较野生型SOD1略强,氧化性环境促进A4V与DNA的结合,还原环境下A4V与DNA的结合同为非特异性结合,A4V蛋白中活性Cu2+被螯合后无法与DNA结合;4.突变体H46R-H48Q与双链DNA 5’-ATGGAATGGAAT-3’序列的结合较WT-SOD1减弱,氧化环境削弱蛋白与DNA的结合,还原环境使H46R-H48Q与DNA的结合变为非特异性结合,铜螯合剂的存在阻遏H46R-H48Q与DNA的结合。以上结果表明,天然Cu2+结合位点突变导致的金属离子缺失并不能使SOD1与DNA的结合,氧化还原环境使WT-SOD1和H46R-H48Q与DNA的结合减弱,但增强A4V与DNA的结合;外加Cu2+螯合剂阻遏SOD1蛋白与DNA的结合。
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