【摘 要】
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磷脂酶 A2（Phospholipase A2,PLA2,EC 3.1.1.4）是一种脂解酶,活性为在 sn-2酰基键上水解磷脂,释放游离脂肪酸和溶血磷脂。PLA2广泛存在于哺乳动物的胰腺、爬行动物的毒液、昆虫毒液等。根据其分布及化学性质,可将PLA2分为分泌型（sPLA2）、胞浆型（cPLA2）和Ca2+非依赖型（iPLA2）。每型PLA2具有不同的功能,sPLA2参与炎症过程,cPLA2参与信
【基金项目】
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国家自然科学基金（31972711和31672553）；
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磷脂酶 A2（Phospholipase A2,PLA2,EC 3.1.1.4）是一种脂解酶,活性为在 sn-2酰基键上水解磷脂,释放游离脂肪酸和溶血磷脂。PLA2广泛存在于哺乳动物的胰腺、爬行动物的毒液、昆虫毒液等。根据其分布及化学性质,可将PLA2分为分泌型（sPLA2）、胞浆型（cPLA2）和Ca2+非依赖型（iPLA2）。每型PLA2具有不同的功能,sPLA2参与炎症过程,cPLA2参与信号转导、神经递质释放,iPLA2影响大脑成熟、皮质发育和神经退变过程。其中PLA2-IB是分泌型PLA2中最具代表性的酶之一,哺乳动物的PLA2-IB研究较为深入,相对而言,对于禽类PLA2-IB 了解较少。本研究将鸡的磷脂酶A2-IB（ChPLA2-IB）基因去掉N端信号肽后克隆至pET-11b原核表达载体中,构建重组质粒pET-11b-ChPLA2-IB,并转化BL21（DE3）感受态细胞中进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot检测,成功获得重组蛋白。同时,构建pLVX-AcGFP1-N1-ChPLA2-IB慢病毒表达质粒,瞬时转染HEK 293T细胞,重组蛋白能在HEK 293T细胞中表达,为单克隆抗体（以下简称单抗）的间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay,IFA）筛选提供了 材料。将原核表达的重组蛋白经镍柱纯化作为免疫原,与弗氏佐剂混合免疫BALB/c雌鼠,取血清效价达到1:51200以上的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以间接ELISA与间接免疫荧光法筛选,经过三次亚克隆后获得4株稳定分泌抗ChPLA2-IB蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D1、2E1、3G9和4C3。亚类鉴定结果表明,1D1与2E1均属于IgG1,3G9与4C3均属于IgG2b。间接ELISA测定细胞培养上清及腹水的效价,细胞培养上清的效价均达到1:6400;1D1和4C3的腹水效价达到1:204800,而2E1和3G9的腹水效价为1:102400。为了鉴定ChPLA2-IB单抗所识别的B细胞表位,对ChPLA2-IB蛋白进行截短表达,对所获单抗与截短的蛋白进行Western blot分析,鉴定4株单抗识别的抗原表位。1D1识别的表位为139RLDKKK144,2E1、3G9、4C3三株单抗针对的抗原表位均为101DEEITC106。有研究表明sPLA2参与炎症反应,本研究采用禽致病性大肠杆菌（Avianpathogenic Escherichia coli,APEC）O2血清型E058株感染13日龄SPF鸡,分别于感染后12h以及24 h处死并收集感染鸡脏器。通过qPCR以及Western blot评估APEC感染鸡中ChPLA2-IB的转录水平和蛋白水平的表达,结果表明,APEC感染后,ChPLA2-IB基因在心脏、肾脏以及空肠中的表达与对照组相比升高,而肺脏和脾脏中的表达明显下降。Western blot中ChPLA2-IB蛋白只在胰腺组织中被检测到,并且感染后的蛋白表达量随感染时间延长而下降,与基因转录水平的qPCR检测结果一致。
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