研究背景脑卒中是全球致死和致残的主要疾病,每年有500万人死于脑卒中,几乎占死亡总数的10%。对于我国来说,脑卒中的发病率十分高,并呈现逐年增加的倾向,严重危害着人们的健康。我国超过40岁人群的患病人数高达1242万,并且将近70%的治愈病人会伴随残疾等后遗症,为社会和家庭产生了很大的影响。目前,脑血管的病发病率呈现出逐年上升的倾向,再加上老龄化的日益严峻,使得我们不得不开始将脑小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)重视起来。有关研究发现,CSVD的发病率约占所有脑卒中发病率的25%-30%。CSVD不仅可引起急性症状,如腔隙性脑梗死、脑出血等,而且也可以痴呆、步态异常、尿潴留和心境障碍等隐匿症状起病。Philip B.Gorelick教授2011年在Stroke杂志发表的研究成果表明20%到40%的老年痴呆症与CSVD有关。但CSVD的具体发病机制研究不明,该病的准确诊断和有效治疗在一定程度上受到了阻碍。目前CSVD的治疗仍缺乏特异性的治疗措施,大部分仍然处于研究阶段,目前的治疗靶点包括降脂、抗血小板、抗炎、血脑屏障调节、前列环素-cAMP系统等。根据CSVD是否为卒中的急性期分为急性期治疗和非急性期治疗。由于没有CSVD的卒中急性期治疗指南,CSVD卒中急性期治疗与大血管卒中相同,可在超急性进行溶栓治疗和在急性期进行抗栓治疗。CSVD的非急性期治疗方案主要为抗栓治疗和血管危险因素的控制。C.Miller Fisher发表在Neurology的早期病理学研究提示,CSVD患者小动脉壁的脂质玻璃样变及纤维素样坏死是由于长期高血压导致,多项临床研究亦显示了 CSVD与高血压之间密不可分的关系,如CNSR(中国国家卒中登记,China National Stroke Registry)研究提示,高血压病史与小动脉闭塞性卒中的复发显著相关,但目前的临床研究尚未证实CSVD与高血压之间的因果关系。SPS3(The Secondary Prevention of Small Subcortical Strokes)结果提示强效降压安全,有潜在降低卒中复发的趋势(HR0.81,95%CI 0.64～1.03,P=0.08),但对改善腔隙性脑梗死后认知功能无益;PRESERVE研究提示,强效降压并不会降低严重脑白质病变患者脑血流量。脑小血管病是一个全脑疾病,对其机制的研究从年龄、血管危险因素等致病原因到引起临床症状之间包含几个层面,从血管的结构功能异常到引起脑组织的损伤,造成脑网络连接的异常,最后导致不同的临床表型。目前已经有多项研究以临床问题为切入点,在临床前开展基础转化研究探索内皮损伤、血脑屏障破坏、炎症及应激等机制在CSVD中的作用,为CSVD的治疗提供新的治疗靶点;以单基因遗传性CSVD为天然模型,开展干预靶点研究,为研究多暴露因素导致的复杂CSVD干预靶点提供科学依据。CSVD病因和发病机制不清楚,治疗和预防有限,亟待寻找新的治疗靶点。既往研究维生素D作为一种脂溶性维生素,除了与心血管疾病、自身免疫、炎症和癌症等存在相关外,其在大脑功能和发育中发挥重要作用,并通过引发炎症、影响免疫功能和神经保护等多种途径影响着神经系统,维生素D的缺乏能够在一定程度上影响神经功能,不利于病人的预后。适量地增加维生素D的摄入还可以通过降低血压、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统、抑制动脉粥样硬化来防治血管损伤。目前己有多项研究表明维生素D缺乏与缺血性脑卒中的临床严重程度和功能预后密切相关,但关于维生素D缺乏与脑小血管病的相关报道却很少见。维生素D于1992年发现并命名,其主要来源是肠道吸收和皮肤合成。血清25-羟维生素D半衰期长,在血液循环中比较稳定,其浓度被认为是测定全面维生素D状态的最可靠的指标,因而可用于测定患者是否存在维生素D含量的不足,它主要是通过维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)介导,VDR是一种控制基因表达或基因功能的配体激活转录因子。VDR基因位于人类染色体12q12-q14上,有14个外显子。据报道,VDR基因中约有470个多态性位点,研究最多是FokI、TaqI、BsmI和ApaI四个位点。一系列基因研究结果已经证实了VDR基因变异与糖尿病、肿瘤、多发性硬化、帕金森病等疾病的关联。关于25-羟维生素D与脑小血管病发生的确切关系的报道仅见于据韩国及印度学者的研究报告。迄今为止,我国仅有一项研究报道了维生素D缺乏与我国南方福建地区脑小血管病患者的总磁共振负荷之间的关系,因此,我们的研究探索北方患病人群来自山东、北京两个比较大型的三甲医院,旨在通过研究25-羟维生素D水平与中国北方地区脑小血管病发病风险之间的可能关系,以期阐明其可能的相关性,并进一步探讨高血压在其中发挥的作用,为脑小血管病的预防及治疗提供新的作用靶点。而维生素D的作用在维生素D受体介导下发挥作用,我们通过检索文献,仅一篇印度学者研究报道VDR基因多态性与脑小血管病所致血管性痴呆的发病有相关性,在世界上其他人群包括在中国并没有VDR基因多态性与脑小血管病的相关研究报道。遗传易感性因素的确定可能会增加我们对脑小血管病病因病理学的了解,并有助于确定新的治疗目标,为进一步阐明脑小血管病的发病机制提供实验及理论依据,以减轻脑小血管病带来的严重社会负担。第一部分 血清25-羟维生素D水平与脑小血管病的相关性研究研究目的:此研究的主要目的是探讨25-羟维生素D和脑小血管病的相关性。研究方法:本研究连续收集从2017年1月到2017年12月在济南市人民医院和首都医科大学附属北京朝阳医院门诊就诊或住院的106名脑小血管病患者和115名正常对照组。所有受试者都进行了详细的神经系统体格检查。NIHSS评分量表和Rankin量表用于评估卒中严重程度和卒中后残疾程度。通过测量25-羟维生素D来确定维生素的状态。受试者分为三个亚组:维生素D缺乏(≤12ng/ml)、不足(12-20ng/ml)和充足(≥20ng/ml)。对所有研究病例在入院或门诊时进行包括血压、身高及体重等数据的基线调查。该过程由专门经过训练并经验丰富的临床医生以及其他工作人员完成。基本数据的主要检测内容有:人口统计学资料;临床表现;主要症状;化验(红细胞、白细胞、血小板、纤维蛋白原、空腹血糖、糖化血红蛋白、血红蛋白、糖化白蛋白、尿酸、同型半胱氨酸、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油三酯、C反应蛋白、白蛋白);既往患病史(是否合并高血压、糖尿病、高脂血症、心脏病及外周血管疾病);脑卒中家族史;不良生活方式(吸烟和饮酒)。我们通过卡方检验分析分类变量的相关性,连续变量之间的相关性用t检验。使用Logistic回归分析检验25-羟维生素D和脑小血管病之间的相关性。通过Logistic回归分析计算比值比和95%可信区间。研究结果:1.脑小血管病组与对照组临床资料比较共纳入221名受试者,其中106名为CSVD患者,115名为对照组。在106名CSVD患者中,80名(75.5%)为男性,平均年龄为61.6±13.2年。CSVD组NIHSS评分和Rankin量表评分分别为3(1-5)和1(0-2)。与对照组相比,CSVD患者与男性、卒中史、吸烟史、高脂血症、较高的收缩压、较高的舒张压以及低密度脂蛋白相关(P<0.05)。2.25-羟维生素D水平与脑小血管病的相关性分析25(OH)D水平在11名患者(10.4%)与25名对照组(21.7%)中结果为充足,19名患者(17.9%)与43名对照组(37.4%)中结果为不足,76名患者(71.7%)与47名对照组(40.9%)中缺乏。CSVD 患者血清 25(OH)D 水平为(10.2±5.6ng/ml),对照组为(14.6±7.5ng/ml),与对照组相比,CSVD患者维生素D缺乏具有统计学意义(P=0.001)。Logistic回归分析显示25(OH)D水平在校正协变量性别、卒中史、吸烟史、高脂血症、收缩压、舒张压以及低密度脂蛋白后独立预测CSVD的发生(OR=0.772,95%CI=0.691-0.862,P=0.001)。与25(OH)D充足组(≥20ng/ml)相比,调整潜在的混杂因素外,我们还发现缺乏组(<12ng/ml)和不足组(12-20ng/ml)的CSVD的比值比分别为5.609(95%可信区间2.006-15.683)和 1.077(95%可信区间 0.338-3.428)。3.25-羟维生素D水平和高血压交互作用与脑小血管病的相关性分析我们还发现在脑小血管病的发生率上维生素D水平和高血压之间存在显著的交互作用,维生素D缺乏(≤12ng/ml)和不足(12-20ng/ml)的高血压患者的比值比分别增加到9.738(2.398-39.540)和 1.108(0.232-5.280)(Pinteracion=0.001)。然而,在非高血压患者中,我们没有发现维生素D状态与高血压之间存在这种交互作用。结论:1.脑小血管病发病风险和25-羟维生素D缺乏之间存在显著的相关性。2.高血压和维生素D缺乏的交互作用增加了罹患脑小血管病的可能性。3.进一步研究25-羟维生素D和脑小血管病的关系有一定的临床价值。第二部分 维生素D受体基因多态性与脑小血管病的相关性研究研究目的:本研究旨在探讨维生素D受体(VDR)基因FokI、TaqI、ApaI、BsmI四个位点多态性与脑小血管病的遗传易感性的关系。研究方法:全部被试者同第一部分研究对象全部为汉族,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对两组的基因进行测定。将血液中的DNA分离出后,利用PCR技术进行扩增,通过相关文献设计所需引物,再对所得的PCR产物进行酶切反应,并用紫外线透射仪进一步成像,从而算出SNP位点的基因型频率。最后还需对所得结果进行验证,随机抽取样本总量的1/10数目的样本,对其PCR扩增产物进行基因测序,测定基因型后和相应的RFLP酶切结果相对比。所得结果通过SPSS22.0统计软件进行分析。利用卡方检验和Logistic回归分析方法检验各个SNP位点基因型、等位基因频率差异及对显性遗传模式、隐性遗传模式、叠加遗传模式进行分析,进一步对基因和疾病之间的关系进行评估。研究结果:1.VDR基因FokI、TaqI、ApaI、BsmI四个位点经卡方检验,均P值大于0.05,均符合Hardy-Weinberg平衡,说明具有群体代表性。2.通过对VDR基因FokI、TaqI、ApaI、BsmI的基因型分布分析发现,(1)在总体样本中,FokI与脑小血管病的发病存在明显相关性,脑小血管病病例组和对照组基因型(P=0.004)分布存在显著差异性。按性别分层后,FokI基因型分布的差异性仅在女性中观察到(P=0.001);(2)对于TaqI来说,在总体样本中其基因型的统计值P=0.901无统计学差异,即使我们按照性别分层后其基因型分布仍无统计学意义,在男性中其统计值P=0.683,在女性中其P=0.725,其与脑小血管病的发病不存在相关性;(3)对于ApaI来说,在总体样本中其基因型分布(P=0.933)无统计学意义,在男性中其基因型分布(P=0.973),在女性中其基因型分布(P=0.972),即使我们进行性别分层,其仍无统计学意义。因此,ApaI与脑小血管病的发病无明显相关性;(4)同样对于BsmI来说,在总体样本中其基因型的统计值P=0.320无统计学意义,在男性中P=0.448,在女性中P=0.528,无统计学差异,其与脑小血管病的发病不存在相关性。3.通过VDR基因FokI、TaqI、ApaI、BsmI等位基因分布分析,VDR基因FokI位点在脑小血管病病例组和对照组中等位基因频率分布存在显著性差异(P=0.001),携带FokI最小等位基因f能够显著性增加脑小血管病的患病风险(OR=2.156,95%CI 1.362-3.414,P=0.001)。按照性别分层后,在男性中等位基因频率分布无显著性差异(P=0.212),而在女性中,携带FokI最小等位基因f可增加脑小血管病的患病风险(OR=4.529,95%CI 2.136-9.606,P<0.001)。TaqI、ApaI、BsmI等位基因频率在脑小血管病病例组和对照组之间分布统计值分别为(0.932,0.757,0.789)P值均大于0.05,无统计学意义。随后我们按照性别进行分层后,在TaqI男性中P=0.443,在TaqI女性中P=0.407,在ApaI男性中P=0.869,在ApaI女性中P=0.812,在BsmI男性中P=0.737,在BsmI女性中P=0.260,均无统计学差异,说明TaqI、ApaI、BsmI与脑小血管病的发病不存在相关性。4.在去除年龄、吸烟史、高脂血症、高血压、糖尿病等混杂因素后,多因素logistic回归分析结果表明,在总体样本的显性模型中,FokI位点仍与脑小血管病的发病风险显著相关(OR=2.042,95%CI 1.073-3.886,P=0.03)。在女性脑小血管病显性模型中FokI位点也与脑小血管病的发病风险相关(OR=10.323,95%CI 2.54-41.956,P=0.001),而在男性脑小血管病显性模型中未发现这种相关性。在总体样本的叠加模型中,FokI位点仍与脑小血管病的发病风险显著相关(OR=1.784,95%CI 1.045-3.045,P=0.034)。在女性脑小血管病叠加模型中FokI位点也与脑小血管病的发病风险相关(OR=3.826,95%CI 1.469-9.964,P=0.006),而在男性脑小血管病叠加模型中未发现这种相关性。在总体样本、男性、女性隐性模型中,未发现FokI位点与脑小血管病的发病风险显著相关。TaqI、ApaI、BsmI三个位点在总体样本、男性及女性脑小血管病样本中,显性模型、叠加模型、隐性模型均未发现其与脑小血管病发病风险相关。5.在脑小血管病病例组中,FokI位点的突变纯合型ff显著降低了 25-羟维生素D的数值,且与野性型FF相比经t检验后P值小于0.05,具有明显统计学意义,杂合型Ff的25-羟维生素D数值与野性型FF相比经t检验后P值大于0.05,没有明显统计学意义,而在对照组中未发现这种相关性。在其他三个多态性位点的病例组及对照组各基因型之间均未发现在25-羟维生素D的数值上有显著差异。结论:1.在中国北方汉族人群中FokI的最小等位基因可显著增加脑小血管病的发病风险,且这种相关性仅在女性中观察到。2.FokI的最小等位基因可降低25-羟维生素D的水平。3.在中国北方汉族人群中TaqI、ApaI、BsmI与脑小血管病的发病不存在相关性。