喉癌(laryngocarcinoma)是耳鼻咽喉科常见恶性肿瘤,其发病率约占全身肿瘤的1-5%,在耳鼻喉科领域中仅次于鼻咽癌和鼻腔癌、鼻窦癌,居第三位。喉癌的病因不明,可能与长期过度烟、酒、有害化学气体刺激有关。喉癌约占喉恶性肿瘤的98.1%,其中喉鳞状细胞癌占85-90%,腺癌约占2%,其余为肉瘤。喉癌和其它肿瘤一样,是一种多基因,多步骤,多阶段的发生过程,发病机制复杂,治疗困难。自20世纪80年代以来,喉癌的治疗取得了较大的进展,手术、放疗、化疗和免疫治疗的联合应用,大大提高了患者5年的生存率。但手术、放疗和化疗引起的并发症多,毒副作用大,因此利用分子生物学技术从分子水平研究喉癌的发病机理并寻找治疗喉癌的分子靶点显得十分迫切。Notch基因于1919年在果蝇体内发现,当时的研究发现如果该基因的部分功能缺失则会在果蝇翅膀的边缘造成一些缺刻(notches),这也正是Notch基因命名的由来。目前,Notch1信号途径是动物细胞中研究最为广泛的信号途径之一,显示出良好的临床应用前景,是许多重要细胞信号途径的交汇点,提示该信号途径在肿瘤的发生中具有重要的地位。陆续的研究表明,Notch1广泛表达于多个不同的物种中,其家族成员的结构具有高度的保守性,在个体系统发育、细胞命运决定、不同细胞的分化、模式形成、肿瘤的发生以及神经退行性疾病等生理病理过程中起着关键作用。目前,Notch1与肿瘤之间关系的报道日益增多,其在肿瘤的发生发展中起着十分重要的作用,包括：乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌以及食管癌等。此外,Notch1信号途径在不同的肿瘤中的作用不完全相同,有时甚至在同一种肿瘤的不同时期作用也不尽相同,最具有典型代表的是宫颈癌组织中的研究,其结果表明,Notch1在宫颈癌发生的早期阶段表现为促癌作用,而晚期阶段表现为抑癌作用,这些研究提示Notch1在不同类型的肿瘤中其表达和功能存在明显的差异,这可能是由于Notch1途径自身的复杂性所决定的。尽管目前Notch1信号途径的研究与日俱增,其重要性也十分明显,然而迄今为止,国内外均未见Notch1信号途径在喉鳞状细胞癌中作用的研究报道,因此作者提出疑问，是否Notch1信号途径在喉鳞状细胞癌的发生发展中也起着十分重要的作用?为了解决这个问题,在本研究中,作者首先通过Real-time PCR、Western blotting以及免疫组织化学方法检测喉鳞状细胞癌组织和声带息肉组织中Notch1和下游靶基因Hes1的表达,并分别分析Notch1和Hes1的表达与喉鳞状细胞癌的临床病理学参数之间的关系,初步探讨Notch1和Hes1在喉鳞状细胞癌中的可能作用。进一步,构建Notch1胞内结构域(Notch intracellular domain, NICD)逆转录病毒载体和绿色荧光蛋白真核表达载体,并筛选出稳定表达NICD的Hep-2细胞株,通过半定量RT-PCR和Western blotting方法检测Notch1和Hesl的表达,接着通过绿色荧光蛋白观察Notch1 NICD所表达的蛋白在Hep-2细胞中的定位,从而探讨外源的Notch1 NICD是否能激活Hep-2细胞中的Notch1信号途径。最后,作者通过CCK-8细胞增殖实验、流式细胞术、Boyden chamber实验、半定量RT-PCR和Western blotting技术研究活化的Notch1信号途径对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡以及细胞的迁移能力的影响,并探讨相关的分子机制。该研究旨在为以Notch1信号途径为靶点的喉鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供可行性的临床依据。第一部分Notchl及其下游靶基因Hesl在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其意义方法(1)采用Real-time PCR方法检测新鲜标本喉鳞状细胞癌组织和声带息肉组织中Notch1和下游靶基因Hes1 mRNAs的相对表达水平。(2)采用Western blotting方法检测新鲜标本喉鳞状细胞癌组织和声带息肉组织中Notch1和下游靶基因Hes1蛋白的相对表达水平。(3)采用免疫组织化学方法检测67例喉鳞状细胞癌组织和26例声带息肉组织中Notch1和Hes1蛋白的表达。(4)统计学处理：应用SPSS 13.0分析软件,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,采用X2检验、t检验和方差分析。P<0.05表示具有统计学意义。结果(1) Real-time PCR和Western blotting的结果均显示,Notch1和Hes1在声带息肉组织中的表达均明显高于喉鳞状细胞癌组织中的表达(P<0.05)。(2) Notch1蛋白的表达主要定位于细胞质,部分见于细胞核,Hes1蛋白的表达主要定位于细胞核。声带息肉组织中Notch1和Hes1蛋白表达的阳性率显著高于喉鳞状细胞癌组织中Notch1和Hes1蛋白表达的阳性率,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(3) Notch1和Hes1蛋白的表达与喉鳞状细胞癌的组织学分化、肿瘤TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05),且分化程度越低,Notch1和Hes1蛋白的表达越低。第二部分Notch1胞内结构域逆转录病毒载体的构建及功能初步研究方法(1) Notch1胞内结构域(Notch1 NICD)全长的克隆及测序鉴定：用Trizol试剂从人胎盘组织中提取总RNA,然后合成cDNA第一链,以合成的cDNA为模板通过PCR扩增Notch1胞内结构域全长,并测序。(2) pCLXSN-Notch1和pEGFP-C1-NICD载体的构建：将带酶切位点的NICD片段分别和逆转录病毒载体pCLXSN和绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1相连,构建pCLXSN-Notch1和pEGFP-C1-NICD载体。(3)稳定表达NICD的Hep-2细胞株的筛选：将病毒上清和polybrene混匀加入培养的Hep-2细胞中,利用G418 (400μg/ml)的培养液进行筛选培养,直到筛选出稳定表达有NICD的Hep-2细胞株。(4)稳定表达株的鉴定：利用半定量RT-PCR和Western blotting技术检测Notch1和下游靶基因Hes1 mRNAs和蛋白的相对表达。(5)利用荧光显微镜观察转染pEGFP-C1-NICD载体后蛋白的定位及研究Notch1途径在喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2中的激活状态。(6)统计学处理：半定量RT-PCR和Western blotting的结果应用Gene Tools进行灰度值分析,上述实验均分别重复三次。应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,.统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA), P<0.05表示具有统计学意义。结果(1)成功构建了Notch1 NICD的逆转录病毒载体pCLXSN-Notch1和绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1-NICD.(2)通过逆转录病毒载体pCLXSN-Notch1载体转染喉鳞癌细胞系Hep-2,成功筛选出稳定表达Notch1 NICD的喉鳞癌细胞株。(3) RT-PCR结果显示,稳定表达Notch1 NICD的喉鳞癌细胞株的Notch1和Hes1 mRNAs的表达均明显上调。(4) Western blotting结果表明,稳定表达Notch1 NICD的喉鳞癌细胞株的Notch1和Hesl蛋白的表达均明显上调。(5) NICD的引入能明显提高Notch1信号途径的下游靶基因Hes1 mRNA和蛋白的表达水平,提示外源性的NICD能够激活Hep-2细胞中的Notch1信号途径。(6)转染NICD的绿色荧光蛋白载体后,能明显见到绿色荧光主要在喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2的细胞核部分表达,进一步提示Notch1途径处于激活状态。第三部分上调Notch1对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的细胞生物学行为影响的研究方法(1)采用新型的CCK-8增殖实验分析激活的Notch1信号途径对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖能力的影响。(2)运用流式细胞术检测激活的Notch1信号途径对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞周期及细胞凋亡的影响。(3)采用Boyden chamber实验分析上调Notch1的表达对喉鳞状细胞癌细胞Hep-2细胞迁移能力的影响。(4)采用半定量RT-PCR和Western blotting方法检测与细胞周期、细胞凋亡以及细胞迁移相关基因表达的变化。(5)统计学处理：半定量RT-PCR和Western blotting的结果应用Gene Tools进行灰度值分析,上述实验均分别重复三次。应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA), P<0.05表示具有统计学意义。结果(1)活化的Notch1信号途径能明显地抑制喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2细胞的增殖。(2)活化的Notch1信号途径能明显地促使喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2细胞静止在G0/G1期,细胞周期相关基因cyclin D1,cyclin E和cdk2表达下调而p53表达上调。(3)活化的Notch1信号途径能明显诱导喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2细胞发生凋亡,细胞凋亡相关基因caspase-3和caspase-9表达上调而Bcl-2表达下调。(4)活化的Notchl信号途径能降低喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2细胞的迁移能力,细胞迁移相关基因基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9表达下调。结论(1) Notch1在喉鳞状细胞癌的发生发展过程中起着十分重要的作用。(2) Notch1的过表达能明显促使细胞周期静止、诱导细胞凋亡以及抑制细胞的迁移,其作用的分子机制可能与相关基因和蛋白水平的变化密切相关。(3)对Notch1基因的操纵可能为喉鳞癌的分子靶向治疗提供理论依据。