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研究背景及目的血管新生指通过成熟血管内皮细胞分裂增殖来形成新的血管。当血流阻塞,缺血的严重程度很大程度上取决于建立侧支循环的能力,血管新生在这一过程中起重要作用。衰老是多种心血管疾病的重要危险因素,随着年龄的增长,血管结构和功能改变,不仅增加了动脉粥样硬化性血管疾病的风险,还对缺血性疾病的预后产生不良影响。内皮细胞衰老时,其增殖、迁移等功能受损,血管新生和损伤修复能力减弱。微小RNA (MicroRNAs, miRNAs)的调控在内皮细胞衰老及血管新生过程中起重要作用。研究发现miR-181b在衰老的内皮细胞中表达上调,但其发挥的作用机制仍不清楚。沉默信息调控因子1(Silent information regulator1, SIRT1)参与内皮细胞衰老和血管新生过程,受多种miRNAs的调控。生物信息学预测发现SIRT1是miR-181b的可能靶基因。本研究旨在通过体外实验研究miR-181b对衰老内皮细胞血管新生功能的影响,并探讨其作用机制。研究方法1.原代培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),通过传代培养计算细胞群体倍增水平(Population doublings, PDL),建立HUVECs衰老模型(PDL44)。2.实时荧光定量PCR在PDL8及PDL44内皮细胞中检测miR-181b,比较其表达水平。为了在PDL44HUVECs中观察miR-181b的作用,在PDL44HUVECs中过表达或抑制miR-181b,分别用MTS法、Scraching实验及成管实验检测内皮细胞增殖、迁移和成管功能。3.通过生物信息学方法预测与miR-181b存在结合位点的靶基因,在PDL44HUVECs中过表达或抑制miR-181b,用实时荧光定量PCR及western blot检测靶基因的表达水平。荧光素酶报告系统实验检测miR-181b与靶基因是否直接结合。研究结果1.与PDL8HUVECs相比,PDL44HVUECs β-半乳糖苷酶蓝染细胞比例增加4.7倍(P<0.001),端粒长度缩短42%(P=0.01),p53及p21表达分别上调69%(P=0.003)和61%(P=0.01),呈现明显衰老状态。2.与PDL8相比,miR-181b在PDL44内皮细胞中表达上调64%(P=0.04)。过表达miR-181b可抑制PDI_M4内皮细胞的增殖功能18%(P<0.001),减少内皮细胞迁移率40%(P=-0.03)；反之,给予miR-181b抑制剂可显著改善PDL44内皮细胞的迁移和增殖功能。给予血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)刺激,未观察到miR-181b对PDL44内皮细胞成管功能的调控作用。3.生物信息学预测发现SIRT1可能是miR-181b的靶基因,但在PDL44内皮细胞中过表达和抑制miR-181b时,并未观察到SIRT1mRNA及蛋白水平的改变,且荧光素酶报告系统实验未检测到1miR-181b与SIRT13’-UTR区的直接结合。结论抑制miR-181b可提高衰老内皮细胞的增殖和迁移能力,提示它可作为一个新的靶点,调控内皮细胞的损伤修复和血管新生。MiR-181b并非通过SIRT1而是其他靶基因调控内皮细胞功能。