micro RNAs(mi RNAs)是一类非编码小分子RNA,通过与信使RNA(messager RNA,m RNA)3’端非编码区(3’untranslated region,3’UTR)序列结合,抑制靶m RNA翻译或促进m RNA降解。mi RNAs作为精细调控因子,在机体复杂的病理生理过程中发挥着重要作用。研究证实,mi RNAs(mi R-1、mi R-133和mi R-499)被证实参与调控心脏发育和心血管系统的正常生理调控过程。mi RNAs在时间和空间上表达谱的改变均可提示不同的病理过程(如急性心肌梗死、心衰)。近年来,血浆mi RNAs分子因其稳定性和易检测性在心血管研究领域中已越来越受到人们的广泛关注,为揭示其分子生物学功能提供新的线索,并有望成为疾病诊断和分子治疗的靶标。mi R-28作为内含子型mi RNA,定位于3号染色体LIM区域LPP(Lipoma Preferred Partner)基因。尽管mi R-28的生物学功能研究尚不充分,但已有研究表明mi R-28可参与调控细胞增殖、分化和凋亡,并异常表达于骨髓增生异常综合征患者的血小板中以及宫颈癌、结直肠癌患者的外周血中。最新研究证实,内含子型mi R-28可直接靶向抑制LPP基因的表达,而LPP的生物学功能主要是促进细胞的迁移和粘附,并在人类肿瘤中处于高表达状态。值得关注的是LPP被证实可促进受损血管平滑肌细胞的迁移和增殖,促进粥样斑块的形成和发展,因此基于内含子mi R-28与宿主基因LPP的作用方式,我们推测mi R-28可能参与了动脉粥样硬化的病理过程,但具体作用机制除了可靶向抑制LPP基因的表达对其他靶基因和作用机制还尚不明确。本研究拟在体外细胞学实验中选取和动脉粥样硬化发生机制较为紧密的Hep G2和THP-1分化的巨噬细胞,采用瞬时转染的方法将mi R-28-5p模拟物或抑制物转入细胞中获得高或低表达的细胞模型。结合生物信息学软件对mi R-28-5p的靶基因进行预测,采用分子生物学技术对Nrf2/Mad2/ERk2进行验证,并拟选定ERK2作为进一步探讨mi R-28-5p生物学功能的主要基因。通过实时定量PCR和蛋白免疫印迹技术探求mi R-28-5p是否参与调控ERK2介导的ABCA1和LXR介导的ABCA1/ABCG1信号通路,从而进一步阐明mi R-28-5p在动脉粥样硬化发生、发展中的分子生物学作用。根据前期体外细胞学实验基础及基因芯片分析发现在不稳定型心绞痛患者血浆mi R-28-5p可作为候选基因区分于表观健康成年人,并采用探针实时定量PCR技术检测mi R-28-5p在不稳定型心绞痛与性别年龄匹配的表观健康成年人血浆中的表达情况,分析其是否具有统计学差异表达或与临床指标是否具有相关性。第一部分mi R-28-5p生物信息学靶基因在Hep G2细胞中的验证目的:在Hep G2细胞中,筛选并验证Nrf2/Mad2/ERK2是否为mi R-28-5p的靶基因,为深入研究mi R-28-5p的生物学功能提供分子基础。方法:应用生物信息学软件对mi R-28-5p的靶基因进行预测和筛选,同时采用Western Blot方法对靶基因进行验证。结果：1 mi RNA-28-5p靶基因的生物信息学预测目前对mi RNAs生物信息靶基因的预测主要是通过应用生物信息学软件进行预测,综合对Target Scan、Pic Tar、Mir Base等多个生物信息学软件预测的结果分析显示:mi RNA-28-5p属于3号染色体,位于3q27-28。本实验选取了预测p值较低的ERK2/Mad2作为下一步候选基因进行验证,同时根据文献报道选用已被证实为mi R-28-5p的靶基因Nrf2作为对照,证实转染实验的可行性(Table 1,2)。2采用Western Blot方法验证Nrf2是mi R-28-5p的靶基因我们应用Western Blot方法对Nrf2在Hep G2是否为mi R-28-5p的靶基因进行验证。本实验将mi R-28-5p模拟物和mi R-28-5p抑制物(mi R-28-5p mimic和inhibitor)分别转染至Hep G2细胞中,通过收集细胞蛋白质观察Nrf2表达情况。在Hep G2细胞中,转染mi R-28-5p mimic组其Nrf2表达量较未转染组显著下调,转染mi R-28-5p inhibitor后Nrf2表达量较未转染组显著上升,证实在Hep G2细胞中Nrf2是mi R-28-5p的靶基因(Figure 1)。3采用Western Blot方法验证Mad2/ERK2是mi R-28-5p的靶基因应用经典的Western Blot方法对Mad2/ERK2在Hep G2细胞中是否为mi R-28-5p的靶基因进行验证。本实验将mi R-28-5p mimic/inhibitor成功转染至Hep G2细胞系中,通过收集细胞蛋白质观察Mad2/ERK2表达情况。在Hep G2细胞中,转染mi R-28-5p mimic组其Mad2/ERK2表达量较未转染组显著下调,转染mi R-28-5p inhibitor后Mad2/ERK2的蛋白表达水平显著上调,表达差异具有统计学意义,证实Mad2/ERK2在Hep G2细胞中是mi R-28-5p的靶基因(Figure 2,3)。小结：从分子生物学角度验证了在Hep G2细胞中mi R-28-5p可直接靶向抑制Nrf2/Mad2/ERK2基因的表达。第二部分mi RNA-28-5p通过靶向抑制ERK2上调ABCA1表达目的:探讨mi R-28-5p是否可通过ERK2影响ABCA1的表达,参与动脉粥样硬化的病理过程。方法:利用瞬时转染的方法将mi R-28-5p mimic和mi R-28-5p inhibitor转染至Hep G2细胞中,通过Western Blot方法检测ABCA1蛋白水平的表达情况,并应用ERK2抑制剂观察对ABCA1表达的影响,探讨mi R-28-5p是否通过靶向抑制ERK2影响ABCA1的表达水平。结果：1在Hep G2细胞中,mi R-28-5p mimic上调ABCA1的表达ERK2作为ABCA1的负向调控因子,我们尝试性的探索mi R-28-5p是否可影响ABCA1的表达。Western blot结果显示,过表达mi R-28-5p可显著性上调ABCA1蛋白的表达,而加入mi R-28-5p抑制物后可显著性下调ABCA1蛋白水平(P<0.05;Figure 1A and B),证实mi R-28-5p在蛋白水平上调ABCA1的表达。2 ERK2抑制剂上调ABCA1蛋白的表达为了进一步确认ERK2在Hep G2细胞中是否对ABCA1蛋白的表达产生影响,我们将ERK2抑制剂(PD98059)与Hep G2细胞过夜孵育。根据已有文献报道,ERK2抑制剂在巨噬细胞诱导ABCA1产生最大效应的剂量为20μM。Western blot结果显示在Hep G2细胞中,ERK2抑制剂在剂量为20μM可显著性上调ABCA1蛋白表达水平,且20μM和40μM对ABCA1的表达无显著性差异(Figure 2)。3 mi R-28-5p通过靶向抑制ERK2上调ABCA1的表达。为了明确mi R-28-5p是否通过ERK2影响ABCA1的表达,我们首先将mi R-28-5p inhibitor转染到Hep G2细胞中以对抗细胞内源性mi R-28-5p,转染30h小时后加入ERK2抑制剂过夜孵育。Western blot结果显示ERK2抑制剂可恢复因mi R-28-5p inhiitor导致的ABCA1表达下调(Figure3)。证实mi R-28-5p作为内含子型mi RNA,可通过靶向抑制ERK2基因上调ABCA1的表达。小结：1在Hep G2细胞中,过表达mi RNA-28-5p可显著上调ABCA1蛋白的表达,抑制胞内mi R-28-5p的表达可显著下调ABCA1的表达。2在Hep G2细胞中,应用ERK2抑制剂可显著上调ABCA1蛋白的表达。3在Hep G2细胞中,mi R-28-5p通过靶向抑制ERK2,上调ABCA1的基因表达。第三部分mi RNA-28-5p对LXRα-ABCA1/ABCG1通路的影响目的:在THP-1分化的巨噬细胞和Hep G2细胞中探讨过表达mi R-28-5p对LXRα介导的ABCA1/ABCG1信号通路的影响。方法:利用瞬时转染的方法将mi R-28-5p mimic转染至THP-1分化的巨噬细胞和Hep G2细胞中,通过Real-time PCR和Western Blot方法检测ABCA1、ABCG1、LXRα转录和翻译水平的表达情况,并探讨mi R-28-5p在介导LXRα-ABCA1/ABCG1通路中的作用。结果：1 mi R-28-5p在THP-1分化的巨噬细胞上调ABCA1的表达我们尝试性的在THP-1分化的巨噬细胞中探索mi R-28-5p对ABCA1表达水平的影响,同时将Hep G2细胞作为对照。本实验中主要应用实时定量PCR和Western Blot方法,结果(Figure 1,2)所示,过表达mi R-28-5p上调ABCA1的基因表达。2 mi R-28-5p在THP-1分化的巨噬细胞和Hep G2细胞中对ABCG1的表达影响ABCA1和ABCG1在调节胆固醇反向转运过程中具有相互协调的作用,ABCG1促进胆固醇从富含脂质的巨噬细胞中流出至HDL颗粒。我们已证实过表达mi R-28-5p可上调ABCA1的表达,为了进一步检测mi R-28-5p对ABCG1的影响,我们利用实时定量PCR和Western Blot方法检测转染mi R-28-5p后ABCG1的表达水平,结果(Figure 3)统计显示:转染mi R-28-5p mimic后上调ABCG1的蛋白表达水平(P<0.05),但转录水平无变化(Figure4)。3 mi R-28-5p上调ABCA1/ABCG1关键调节因子LXRalpha的蛋白表达LXR的主要生物学功能是调控ABCA1/ABCG1的表达。在HDL的生物合成和转运过程中,LXRalpha的活化或上调均可直接提高ABCA1/ABCG1的表达水平进而促进胆固醇的反向转运,影响动脉粥样硬化的发生和发展。基于mi R-28-5p对ABCA1/ABCG1的上调作用,本部分进一步观察mi R-28-5p对LXR的基因表达的调节作用。我们利用实时定量PCR和Western Blot方法检测LXRalpha和LXRbeta的m RNA和蛋白水平。结果显示(Figure 5):LXRalpha的蛋白表达水平在THP-1分化的巨噬细胞和Hep G2细胞中mi R-28-5p转染组中表达明显升高(p<0.05),但在m RNA水平上无明显意义(Figure 6)。小结：1在THP-1分化的巨噬细胞中,mi RNA-28-5p mimic转染后上调ABCA1的基因表达。2在THP-1分化的巨噬细胞和Hep G2细胞中,mi RNA-28-5p mimic转染后上调ABCG1蛋白水平,对m RNA水平没有显著性影响。3 mi RNA-28-5p mimic转染后,巨噬细胞中LXRa的基因表达在翻译水平被上调。第四部分mi RNA-28-5p在不稳定型心绞痛患者中的表达及意义目的:分析mi R-28-5p在不稳定型心绞痛患者血浆中的表达水平,与性别、年龄匹配的表观健康成年人作为对照,并探讨mi R-28-5p表达水平与疾病诊断的可行性和相关临床资料的相关性。方法:从380例冠心病患者中筛选出39例不稳定型心绞痛患者,同期从我院健康体检中心中选取年龄、性别匹配的健康体检者28名作为对照并应用定量Real-time PCR检测mi RNA-28-5p在不稳定型心绞痛患者及与性别、年龄相匹配的表观健康成年人中的差异表达情况,应用Graph PAD Prism5.0独立样本t检验的统计学方法研究其表达水平在不稳定型心绞痛患者中的意义,并探讨是否与脂代谢临床指标具有相关性。结果:1临床资料的数据分析1.1不稳定型心绞痛患者39例,其中21例为男性,18例为女性;年龄范围为35至70岁,平均年龄58±9岁。所有患者根据ACC/AHA 2007年不稳定型心绞痛/非ST段抬高型心肌梗死诊断指南。表观健康体检人群28例,其中男性13例,女性15例,平均年龄55±8岁。1.2不稳定型心绞痛和表观健康对照组间临床指标无明显统计学差异如空腹血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和吸烟史(P>0.05);组间总胆固醇(CHOL)高密度脂蛋白(HDL-C)存在显著性差异(P<0.05,Table 1)。2血浆mi R-28-5p的差异表达分析2.1我们前期芯片研究显示血浆中mi R-28-5p和mi R-28-3p可作为不稳定型心绞痛患者区分表观健康成年人的候选基因。芯片分析显示mi R-28-5p表达水平要高于mi R-28-3p,但二者的血浆水平远低于内参mi RNA-423-5p。因此我们选择表达峰值稍高的mi R-28-5p做进一步验证实验(Table 2)。应用Taq Man探针法检测在不稳定型心绞痛和表观健康对照组人群中外周血血浆mi R-28-5p的表达水平。2.2不稳定型心绞痛患者组血浆mi R-28-5p的表达水平2-?Ct为(0.026,(0.0077,0.0460)),表观健康对照组血浆中mi R-28-5p的表达水平2-?Ct为(0.0058,(0.0038,0.0118))。不稳定型心绞痛患者血浆中mi R-28-5p的表达水平显著性升高,差异具有统计学意义(Figure 1A)。3应用ROC曲线分析血浆mi R-28-5p表达对不稳定型心绞痛的诊断价值为了进一步评估mi R-28-5p作为潜在冠心病分子靶标的可行性,我们进行了ROC曲线分析。其曲线下面积(AUC)介于0.5至0.7时对疾病的诊断具有较低的准确性,AUC在0.7-0.9间具有一定的准确性,AUC大于0.9时则具有较高的准确性。分析显示血浆中mi R-28-5p表达水平对于不稳定型心绞痛患者具有一定的诊断价值,AUC为0.714(Figure 1B;95%可信区间(CI):0.5860-0.8426)。4相关性分析为了进一步研究影响不稳定型心绞痛患者mi R-28-5p表达水平的因素,我们对临床数据进行相关性分析,血浆mi R-28-5p表达水平与HDL检验值呈正相关(R=0.327;p=0.042;Figure 2)。小结：在不稳定型心绞痛患者中,血浆mi RNA-28-5p水平被显著性上调,且与血清HDL-C水平正相关,提示血浆mi R-28-5p可作为冠心病早期防治、预后评价的潜在的分子标志物,为深入研究mi R-28-5p在体内胆固醇代谢和不稳定型心绞痛间的内在联系提供了新的线索。