蟹类作为一种营养价值高、肉质鲜美的水产品,广受消费者喜爱,但是随之引起的食物过敏发病率持续上升。本文以拟穴青蟹（Scylla paramamosain）为研究对象,对青蟹中的新型过敏原肌质钙结合蛋白（sarcoplasmic calcium binding protein,SCP）进行重组表达,对其抗原表位进行定位分析,探讨酶法交联反应、美拉德反应对重组SCP（rSCP）致敏性的影响,以期为过敏性疾病诊断和低致敏性食品开发提供理论依据。本研究首先从拟穴青蟹肌肉中纯化出分子量约20 kDa的SCP,通过免疫新西兰大白兔获得兔抗青蟹SCP血清,纯化得到兔抗SCP-IgG多克隆抗体。构建表达载体pET-22b-SCP,在E.coli Rossetta菌株中诱导表达获得可溶性的rSCP。圆二色谱、抑制性ELISA、免疫杂交分析结果显示,rSCP与天然SCP（nSCP）均呈典型的α/β蛋白特征,在Ig E结合活性方面能够相互抑制,在高温（60℃¹00℃）、弱酸（pH 2.0⁵.0）、强碱（pH 10.0¹1.0）条件下均易发生聚合,表现出结构、免疫结合能力及理化特性的一致性。体内动物及体外细胞试验结果显示,rSCP使BALB/c小鼠的脾脏淋巴细胞Th2型相关细胞因子IL-4和IL-13分别升高至300 pg/m L、250 pg/mL,也能够上调蟹类过敏患者嗜碱性粒细胞的表面分子CD63和CD203c水平。不同甲壳类动物的SCP与rSCP可以竞争结合虾蟹类过敏患者血清中Ig E,且rSCP的抑制效果最强,提示rSCP可以代替天然蛋白用于过敏原组分诊断。其次,采用嗜碱性粒细胞活化试验确定SCP过敏患者,并用鼠抗人anti-IgE富集SCP过敏患者血清中的IgE;以兔抗SCP-IgG多克隆抗体和SCP过敏患者血清Ig E为靶蛋白,经过噬菌体展示技术亲和淘选共定位得到3个IgG抗原表位和6个IgE抗原表位,值得指出的是IgG表位的氨基酸组成均在IgE表位中存在。这些抗原表位主要分布在SCP的一级序列保守区域、二级结构的α-螺旋末端和无规则卷曲柔性区域、蛋白质空间结构的表面;其中Epitope 1(N₃₇T₃₈L₃₉I₃₈E₄₁G₄₂R₄₃Y₅₁1 N₅₄T₁₁₂)为IgE与IgG所共同识别的抗原表位,在淘选到的克隆子序列中重复性最高,推测为SCP的关键表位。最后,通过分析食品加工处理对rSCP致敏性的影响,发现酪氨酸酶作用下的rSCP酶法交联反应产物（CL-SCP）、木糖与r SCP发生美拉德反应的产物（MR-SCP）致敏性均降低。圆二色谱分析显示,MR-SCP、CL-SCP的α螺旋含量分别降低至16.4%和16.2%,β折叠的含量分别升高至32.2%和31.3%。与rSCP相比,MR-SCP、CL-SCP激活患者嗜碱性粒细胞表达的CD63和CD203c比例下降。结合SCP抗原表位分析认为,酪氨酸酶可以催化交联SCP蛋白表位区域的酪氨酸残基,而美拉德反应可以修饰SCP蛋白的关键抗原表位区域,提示这两种加工方法可以改变过敏原结构与抗原表位,从而降低SCP的致敏性。