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目的:探讨lnc RNA MALAT1海绵mi R-200a-3p调节Gab1在肝门胆管癌细胞中的表达,进而调节肝门胆管癌细胞VEGF自分泌,为肝门胆管癌的临床治疗提供理论基础。研究方法:本实验选用购买于上海艾研生物科技有限公司和北纳生物科技有限公司的人肝门胆管癌细胞ICBD-1和TFK-1,以及正常人肝内胆管上皮细胞HUM-CELL-0035（北京元唐盛兴科技有限公司）。细胞在10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养（在VEGF自分泌试验中细胞转染24h后更换为2%胎牛血清的DMEM培养基继续培养）。1.应用RT-PCR检测TFK-1中VEGFR-2和Gab1表达。2.应用real-time PCR检测ICBD-1、TFK-1及HUM-CELL-0035中Gab1和VEGFR-2 m RNA的表达情况。3.培养ICBD-1、TFK-1及HUM-CELL-003至对数生长期,应用real-time PCR检测上述三种细胞lnc RNA MALAT1和mi R-200a-3p的表达情况。4.设计三条lnc RNA的si RNA片段及一条无关干扰序列（negative control,NC）片段,转染至对数期的ICBD-1和TFK-1,48h后应用real-time PCR检测MALAT1的表达并筛选出干扰效果最高的lnc RNA si RNA片段进行转染。应用real-time PCR检测lnc RNA MALAT1-si RNA对两种细胞mi R-200a-3p和Gab1表达的影响。5.将mi R-200a-3p mimic转染至对数生长期的ICBD-1和TFK-1,48h后应用real-time PCR检测mi R-200a-3p mimic对两种细胞Gab1表达的影响。6.设计并构建Gab1野生型过表达载体（Gab1-WT）,Gab1-WT和已筛选好的si Gab1转染至对数期ICBD-1和TFK-1,应用western blot检测两种细胞中Gab1表达量变化情况。7.si Gab1和Gab1-WT分别转染ICBD-1和TFK-1,转染24小时后更换为2%胎牛血清的培养基继续培养24小时,应用western blot分别检测ICBD-1和TFK-1细胞中Gab1变化对VEGFR-2影响。8.正常培养ICBD-1和TFK-1,选择对数生长期细胞转染si Gab1和Gab1-WT,转染24h后低浓度胎牛血清培养24h,收集各组细胞培养上清,应用ELISA检测各组细胞上清中VEGF-A和VEGF-C含量变化。9.免疫荧光检测Gab1和p-VEGFR-2细胞内分布变化及外源VEGF对肿瘤细胞影响情况。实验结果:1.应用RT-PCR证实TFK-1中同样存在VEGFR-2和Gab1表达。Real-time PCR发现与HUM-CELL-0035相比,ICBD-1和TFK-1细胞中Gab1及VEGFR-2m RNA表达均增多。这与之前报导的它们在肝门胆管癌组织中的表达情况结果一致。2.Real-time PCR检测两种细胞lnc RNA MALAT1和mi R-200a-3p。与HUM-CELL-0035相比,两种细胞lnc RNA MALAT1 m RNA表达量均增多,而mi R-200a-3p m RNA表达量均减少。3.筛选干扰效率最高的lnc RNA si RNA片段转染两种细胞,real-time PCR检测lnc RNA MALAT1-si RNA对两种细胞mi R-200a-3p和Gab1表达的影响。与NC组相比,两种细胞lnc RNA MALAT1-si RNA组mi R-200a-3p m RNA表达量均增多,同时Gab1 m RNA表达量均减少。4.Real-time PCR检测mi R-200a-3p mimic对两种细胞Gab1表达的影响。与mimic-NC组相比,两种细胞mi R-200a-3p mimic组mi R-200a-3p m RNA表达量均增多的同时Gab1 m RNA表达量均减少。5.Western blot检测两种细胞中Gab1变化对VEGFR-2影响。与NC组相比,两种细胞si Gab1组p-VEGFR-2减少;而与Gab1-Vector组相比,两种细胞Gab1-WT组p-VEGFR-2增多。Gab1变化对VEGFR-2表达量无明显影响。6.ELISA检测各组细胞上清中VEGF-A和VEGF-C含量变化。与NC组相比,两种细胞si Gab1组细胞上清中VEGF-A和VEGF-C含量均减少;与Gab1-Vector组相比,两种细胞Gab1-WT组细胞上清中VEGF-A和VEGF-C含量均增多。7.免疫荧光检测Gab1和p-VEGFR-2细胞内分布变化。与Gab1-Vector组相比,两种细胞Gab1-WT组Gab1和p-VEGFR-2表达量增多,p-VEGFR-2向细胞质和细胞核移动,p-VEGFR-2核聚集增多。8.免疫荧光检测外源VEGF对肿瘤细胞影响。向各组细胞中加入VEGF-A50ng/ml,5min后两种细胞的Gab1-Vector和Gab1-WT组细胞均出现VEGFR-2磷酸化增多,p-VEGFR-2向细胞质和细胞核移动,p-VEGFR-2核聚集增多。与Gab1-Vector组相比,两种细胞Gab1-WT组出现更多的VEGFR-2磷酸化和p-VEGFR-2向细胞内移动和核聚集。结论:1.LncRNA MALAT1海绵miR-200a-3p调节Gab1在肝门胆管癌细胞中的表达。2.表达VEGFR-2的肝门胆管癌细胞存在Gab1调节的VEGF自分泌,Gab1通过调节p-VEGFR-2的核聚集调节VEGF自分泌。3.外源VEGF协同增强自分泌VEGF对VEGFR-2的磷酸化和核聚集。