背景和目的:国家癌症中心《2019年全国癌症报告》显示全球近50%的食道癌新病例在中国,给患者本人、家庭造成严重的心理和经济负担。由于食管癌早期预后较好,而且我国在高患病率地区也积极开展食管癌筛查项目,食管癌的死亡率大大降低。但食管癌患者的预后仍不够理想。已有研究表明相关基因的缺失、突变或扩增可以显著影响食管癌的发生和发展过程。因此,探索调控食管癌的发生、发展过程的关键分子将进一步提高对食管癌发病机理的认识。同时,通过探索相关分子功能及作用机制,可以筛选一些敏感性高、特异性强的新的分子诊断标记物,为食管癌的早期诊断及临床的靶向治疗提供依据。非编码RNA是细胞内转录出众多没有蛋白质编码能力的RNA分子,如miRNA,lncRNA和circRNA。据报道,多种非编码RNA参与控制各种细胞功能,如细胞凋亡、细胞生长、自噬、EMT和细胞周期等。环状RNA（circRNA）是细胞内线性RNA首尾结合形成的一种特殊的非编码RNA,其可以通过调控下游miRNA、修饰亲本基因、调控靶基因的转录和剪接来调节基因表达。目前临床和基础研究显示circRNA广泛参与调控食道癌的发生、发展过程,其中一些circRNA可以作为食管癌新的早期诊断、预后监测及靶向治疗的标志物。CircATXN7（circBase ID:hsacirc0066436）contains 587 nucleotides and is produced from the ATXN7 gene（exons 9-11）in chr3:63973734-63976535)是近年新鉴定的一种环状RNA,目前对该基因的研究还比较少,并且发现circATXN7在食管癌异常表达。因此本研究首次探究circATXN7在食管癌中表达及其生物学作用,并初步研究了其发挥功能的分子调控机制。此外,本课题长期从事中药复方在食管癌治疗中的探索与应用。如刘沈林教授根据食管癌发病机制与中药理论,提出采用干凉濡润,胃以和降为顺,整体配合局部用药来治疗食管癌,并提出因人而异的用药和药量的精准治疗,这些指导方法对食管癌的临床治疗具有重要的意义。本研究是根据刘沈林教授多年食管癌临证经验,通过数据挖掘出:“健脾消膈方”,应用于食管癌患者的中西医结合治疗。因此本项目准备通过网络药理学,结合细胞和动物实验研究该复方的药效和初步的抗肿瘤机制,为后期深入研究及临床的应用提供理论依据和指导。本研究包括三部分内容:第一部分探究circATXN7在食管癌组织中的表达及对细胞增殖与侵袭的影响;第二部分探究circATXN7通过miR-4319/NLRC5（NLR Family CARD Domain Containing 5,NLRC5）调控食管癌细胞增殖与侵袭的分子机制;第三部分初步探究健脾消膈方通过激活Caspase-3和下调NLRC5表达抑制食管癌细胞体外和体内的增殖能力。第一部分CircATXN7在食管癌组织中的表达及对细胞增殖与侵袭的影响目的:探讨circATXN7在食管癌组织中的表达、及与患者临床病理相关性分析、同时研究对细胞增殖与侵袭的影响;方法:1.收集食管癌组织,通过qRT-PCR检测组织中circATXN7的表达水平,并根据其表达水平高低进行分组,分析与circATXN7的表达水平显著相关的临床病理因素;2.通过Kaplan-Meier单因素分析和COX多因素分析筛选出影响食管癌患者无进展生存期的独立危险因素;3.采用 qRT-PCR 检测五种食管癌细胞（Eca-109、EC-9706、KYSE-30、KYSE-150、TE-1）以及HET-1A（人正常食管细胞）中circATXN7的表达水平。4.根据circATXN7序列,分别合成该基因的过表达慢病毒载体（CircATXN7）和空白对照组（Vector,没有插入circATXN7基因序列的空载体）,构建两个敲低载体（shRNA#1和shRNA#2）和空白对照载体（shRNA control）,分别转染食管癌细胞后qRT-PCR进行检测;5.MTT细胞活性检测试剂盒、Edu法和平板克隆形成实验检测敲低或过表达circATXN7对食管癌细胞活性、增殖能力和克隆形成能力的影响。Transwell实验检测敲低或过表达circATXN7对食管癌细胞迁移能力的影响。结果:1.通过RNaseR耐受实验和Sanger测序分析证明circATXN7在食管癌组织中表达;qRT-PCR检测结果显示CircATXN7在食管癌组织中高表达（与癌旁组织相比）（p＜0.01）。与正常食管细胞相比,CircATXN7在食管癌细胞系中高表达,其中EC-9706的表达水平最高,其次是KYSE-150、TE-1、KYSE-30和Eca-109;2.CircATXN7的表达高低与食管癌患者的TNM分期、淋巴结转移情况具有显著的相关性（P＜0.05）;3.Kaplan-Meier单因素分析结果显示肿瘤侵袭深度、不同分化程度、TNM分期、circATXN7表达情况的PFS具有显著性差异（P＜0.05）,CircATXN7低表达的患者PFS较长。COX多因素分析结果显示,分化程度、肿瘤侵袭深度、TNM分期、circATXN7表达情况均为影响食管癌预后的独立的预后因子（P＜0.05）;4.过表达circATXN7能促进Eca-109细胞的增殖,敲低circATXN7能显著抑制EC-9706细胞的增殖能力。过表达circATXN7能促进Eca-109细胞的DNA的复制能力。敲低circATXN7能显著抑制EC-9706细胞的DNA复制能力。过表达circATXN7能促进Eca-109细胞的克隆数量,敲低该基因则能显著抑制EC-9706细胞的克隆数量;6.过表达circATXN7后能显著降低Eca-109细胞在G0/G1期的百分比,相应的显著增加细胞在S期和G2/M期百分比。敲低circATXN7后能显著提高EC-9706细胞在G0/G1期的百分比,降低S期的百分比,而G2/M期的细胞比率也降低,但统计学不具有显著差异;7.Transwell实验显示过表达circATXN7能促进Eca-109细胞侵袭与迁移能力;敲低circATXN7能显著抑制EC-9706细胞的侵袭与迁移能力;结论:CircATXN7在食管癌组织及细胞中高表达,与患者的临床病理特征具有显著的相关性。circATXN7的表达与食管癌细胞增殖、克隆、周期、侵袭和迁移的能力呈正相关。第二部分CircATXN7通过miR-4319/NLRC5调控食管癌细胞增殖与侵袭的分子机制目的:探究circATXN7通过miR-4319/NLRC5调控食管癌细胞增殖与侵袭的分子机制。方法:1.通过RNA-FISH分析circATXN7在食管癌细胞内的定位,然后分离总RNA,qRT-PCR检测该基因在细胞核和细胞质的含量比例;2.通过生物信息学分析和预测circATXN7序列中可能结合的miRNA,再通过qRT-PCR检测敲低或过表达circATXN7对下游靶miRNA表达的影响。用qRT-PCR检测转染合成miR-43 19的mimics和inhibitor后对细胞内miR-4319的表达水平;3.通过RNA结合蛋白免疫沉淀和双荧光素酶报告基因确定circATXN7与miR-4319的结合活性;4.通过qRT-PCR检测miR-4319在食管癌细胞和组织中的表达情况,并分析circATXN7与miR-4319在组织中的相关性;5.采用平板克隆形成实验确定circATXN7通过miR-4319调控食管癌增殖能力的影响;6.用生物信息软件预测miR-4319可能调控的下游靶基因,qRT-PCR检测过表达miR-4319对下游靶基因表达的影响,双荧光素酶报告基因检测miR-4319与NLRC5的结合活性;7.Western blot检测过表达或抑制miR-4319对NLRC5表达的影响,Western blot检测circATXN7 通过 miR-4319 调控 NLRC5 的表达;8.建立敲低和过表达NLRC5的载体并转染细胞,通过克隆形成实验和Transwell实验检测敲低和过表达NLRC5对食管癌细胞增殖与侵袭的影响,Western blot检测敲低和过表达NLRC5对食管癌细胞内相关蛋白如p21、PCNA、Ki-67、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达的影响;9.建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察稳定敲低circATXN7对食管癌细胞在体内增殖的影响,通过qRT-PCR检测移植瘤组织中的circATXN7和miR-4319的表达水平,Western blot检测移植瘤组织中NLRC5的表达;结果:1.RNA-FISH显示绿色荧光标记的circATXN7主要定位在细胞质中,qRT-PCR检测结果证实circATXN7主要分布在细胞质中;2.在线分析预测circATXN7序列中可能含有多个miRNA:如hsa-miR-9-5p、hsa-miR-3184-5p、has-miR-4319、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-3196、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-1286,qRT-PCR进一步证明过表达或敲低circATXN7能显著影响miR-4319;3.双荧光素酶报告基因和RNA结合蛋白免疫沉淀结果表明circATXN7与miR-4319之间存在相互作用。miR-4319和circATXN7的表达具有负相关性,其中R2=0.28747,P值小于0.001;4.转染miR-4319 mimics后的Eca-109细胞能显著抑制细胞的克隆形成能力,过表达circATXN7能显著减弱过表达miR-4319对Eca-109细胞的克隆形成的抑制能力。抑制EC-9706细胞内miR-4319的表达能显著促进细胞的克隆形成能力,敲低circATXN7能显著减弱抑制细胞内miR-4319的表达对细胞的克隆形成的促进作用;5.过表达miRNA-4319后能显著抑制NLRC5、CD147和ENTPD4的表达,其中NLRC5的抑制效果最为显著。在NLRC5突变型（Mut）组中,与miRNC相比,添加miR-4319 mimics后对荧光素酶活性没有显著的影响,而在NLRC5野生型（Wt）组中,与miR NC相比,添加miR-4319 mimics后能显著抑制荧光素酶活性。Western blot检测结果显示,与miRNC组相比,转染不同浓度的miR-4319 mimics（30nM和60nM）能显著抑制NLRC5的表达,并具有一定的浓度依赖性。而在EC-9706细胞中,与inhibitor NC组相比,转染不同浓度的miR-4319 inhibitor（50nM和100nM）能显著促进NLRC5的表达,并具有一定的浓度依赖性;6.过表达NLRC5能显著促进食管癌细胞内NLRC5的表达。转染敲低NLRC5后能显著敲低EC-9706细胞内NLRC5的表达水平。与Vector组相比,过表达NLRC5能显著促进食管癌细胞的侵袭与克隆形成能力,而在EC-9706细胞中,与干扰空白组相比,敲低NLRC5后能显著抑制食管癌细胞的增殖与侵袭能力;7.过表达NLRC5能显著抑制p21的表达,促进Ki-67和PCNA的表达。过表达NLRC5能显著抑制E-cadherin的表达,促进N-cadherin和Vimentin的表达;8.与shRNA contorl组相比,shRNA#2组荷瘤肿瘤体积显著变小,荷瘤肿瘤组织的重量显著减轻;9.用qRT-PCR检测荷瘤组织中circATXN7、miR-4319和NLRC5的表达水平,结果显示与control-shRNA组相比,circATXN7在shRNA#2组中的表达水平显著降低,而miR-4319的表达水平显著升高,同时NLRC5的表达水平也相应的显著降低。Western blot检测结果显示与control-shRNA组相比,NLRC5在shRNA#2组中的表达水平显著降低。上述体内结果表明在荷瘤组织中敲低circATXN7能显著促进miR-4319的表达水平同时抑制NLRC5的表达;结论:circATXN7调控食管癌增殖、侵袭和迁移的分子机制为靶向miR-4319/NLRC5通路。第三部分健脾消膈方通过激活Caspase-3和下调NLRC5表达抑制食管癌细胞体外和体内的增殖能力目的:探索健脾消膈方治疗食管癌的分子靶点及其对细胞增殖和凋亡的影响方法:1.把健脾消膈方提取液母液用细胞培养基配置成不同浓度后（0.5mg/ml、1mg/ml、2 mg/ml和4 mg/ml）,处理正常食管细胞系（HET-1A）、食管癌细胞系（Eca-109、EC-9706和KYSE-30）12h、24h、36h和48h,用MTT检测健脾消膈方提取液对食管癌细胞增殖能力的影响。2.通过流式细胞仪检测不同浓度（0mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml）健脾消膈方提取液对食管癌细胞Eca-109和KYSE-30凋亡的影响。3.用Hoechst 33342进行荧光染色,显微镜下观察不同浓度（0mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4 mg/ml）健脾消膈方提取液对食管癌细胞核形态的影响。4.通过网络药理学（TCMSP数据库、GeneCards数据库和OMIM数据库）进行健脾消膈方靶点和食管癌靶点的筛选。5.通过GO基因功能注释和KEGG通路富集分析健脾消膈方可能影响的下游信号通路。6.凋亡蛋白芯片检测健脾消膈方提取液对食管癌细胞凋亡相关信号通路的影响,并用western blot检测主要的相关蛋白的表达情况。7.建立食管癌裸鼠模型,每只裸鼠的给药剂量为:每天2次,一次150mg的健脾消膈方提取液,给药时间为:上午10点,下午4点进行灌胃,而空白对照给予等体积的PBS缓冲液,连续给药21天。8.剥离移植瘤组织后固定,进行HE染色和免疫组织化学分析Ki-67和Cleaved Caspase-3,同时分析对心、肝、脾、肺和肾的影响。结果:1.MTT检测结果显示,在正常食管细胞系（HET-1A）细胞中,与空白对照（0 mg/ml）相比,低浓度健脾消膈方提取液（0.5mg/ml）培养48h后对正常食管细胞没有显著的影响,而不同浓度的健脾消膈方提取液（1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml）对食管细胞增殖抑制能力也不同,并呈现出浓度依赖性,其48h时的半数抑制浓度为4.13±0.53mg/ml,Eca-109 细胞的 48h 半数抑制浓度为 1.59±0.21mg/ml,EC-9706 细胞的48h的半数抑制浓度为2.31±0.26mg/ml,KYSE-30细胞的48h半数抑制浓度为2.17±0.32mg/ml。2.在Eca-109细胞中,与空白对照（0 mg/ml）相比,低浓度健脾消膈方提取液（0.5mg/ml）培养48h后能显著促进Eca-109细胞的凋亡,随着浓度的增加,健脾消膈方提取液（1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml）促进食管癌细胞凋亡的作用也越显著,并呈现出浓度依赖性。KYSE-30检测结果与Eca-109细胞相似。3.在Eca-109细胞中,与空白对照（0 mg/ml）相比,低浓度健脾消膈方提取液（0.5mg/ml）培养48h后能导致少量的细胞核发生聚缩,随着浓度的增加,发生细胞核聚缩的数量也越多,并呈现出浓度依赖性,在KYSE-30细胞中观察到类似的结果。4.通过TCMSP数据库和SwissTargetPrediction网站共获得健脾消膈方靶点共361个。GeneCards数据库和OMIM数据库分别获得靶点6022个和561个。将健脾消膈方靶点与GeneCards和OMIM数据库取交集后共得到19个相交靶点,即健脾消膈方作用于食管癌的关键靶点。5.拓扑属性分析上述19个靶点蛋白互作网络图,结果显示度值最高的CASP8（Caspase-8）能与11个蛋白发生相互作用。6.凋亡蛋白芯片检测结果显示与空白对照（0mg/ml）相比,4mg/ml健脾消膈方提取液主要显著促进 Bax、Phospho-Rad17（S635）、Claspin、HSP70、HSP27、HSP60、Cytochrome c、Fas、Cleaved Caspase-3 和 XIAP 的表达,抑制 Bcl-2 的表达。7.Western blot检测结果显示,与空白对照（0mg/ml）相比,健脾消膈方提取液处理食管癌细胞后能显著促进Bax表达,下调Bcl-2表达,并激活caspase-3成执行凋亡功能的 Cleaved Caspase-3。8.此外,KEGG Pathway分析显示健脾消膈方还能影响NOD样受体信号通路,即健脾消膈方提取液能显著抑制食管癌细胞内NOD2和NLRC5的表达,而对NOD1和NLRP3的表达没有显著的影响。9.与空白对照（0mg/ml）肿瘤组织体积相比,服用150mg一天两次的健脾消膈方提取液21d后明显抑制荷瘤组织的生长。10.HE染色显示,空白对照和移植瘤组织中细胞核质比高、有大量的核分裂,排列不规则是肿瘤组织典型特征。免疫组织化学染色显示在空白对照的荷瘤组织中Ki-67的表达较高,Cleaved Caspase-3几乎不表达,150mg一天两次的健脾消膈方提取液处理的移植瘤组织中Ki-67的表达水平较低,Cleaved Caspase-3的表达水平较高。11.HE染色显示,与空白对照组相比,150mg一天两次的健脾消膈方提取液对裸鼠心脏、肝、脾、肺和肾脏组织也没有组织学可见的变化。结论:健脾消膈方能通过激活凋亡关键分子Caspase-3和免疫调节相关分子NLRC5抑制荷瘤裸鼠体内食管癌的增殖能力,促进食管癌细胞的凋亡,而对裸鼠的主要器官（心肝脾肺肾）组织形态学上没有显著的影响。全文总结:（1）CircATXN7在食管癌组织中高表达,与患者的临床病理特征具有显著的相关性,并参与调控与食管癌细胞增殖、克隆、周期、侵袭和迁移的能力,分子机制研究显示circATXN7调控食管癌增殖、侵袭和迁移的分子机制为靶向miR-4319/NLRC5通路。（2）中药健脾消膈方能通过激活凋亡关键分子Caspase-3和下调免疫相关分子NLRC5表达抑制食管癌细胞体外和体内的增殖能力。