论文部分内容阅读
目的1.本研究在文献研究的基础上,选用TAC(主动脉弓缩窄术)致C57/BL6小鼠心肌肥厚模型,检测小鼠超声心动图及解剖学数据,并取材行心肌组织HE染色计算心肌细胞面积大小,评估小鼠心肌肥厚模型成功与否。2.研究中药制剂复方罗布麻片对心肌肥厚的保护作用及其相关机制。实验周期内记录各组小鼠生存情况及死亡率,检测小鼠超声心动图及小鼠解剖学数据,并行心肌组织HE染色及天狼星红染色;检测AKT(蛋白激酶B),P-AKT(磷酸化蛋白激酶B),ERK(细胞外信号调节蛋白激酶),P-ERK(磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶),GATA4(锌指转录因子结合蛋白4),CaN(钙调神经磷酸酶)及NFATc3(活化T细胞核因子c3)等蛋白的表达。方法实验一成年雄性C57/BL6小鼠,复制TAC(主动脉弓缩窄)致心肌肥厚模型,随机分成TAC致心肌肥厚模型组(TAC组)和假手术组(SHAM组);术后正常饲养2周,实验周期内观察2组小鼠生存状态,术后2周超声心动图检测AoPg(主动脉弓压力阶差)、HR(心率)、LVAWd(舒张末期左室前壁厚度)、LVPWd(舒张末期左室后壁厚度)、LVIDd(舒张末左室内径)、LVAWs(收缩末期左室前壁厚度)、LVPWs(收缩末期左室后壁厚度)、LVIDs(收缩末左室内径)、EDV(舒张末左室容积)、ESV(收缩末左室容积),并计算EF%(左室射血分数)、FS%(左室短轴缩短率)、LVW(左心室重量)等心脏功能学数据;术后2周解剖小鼠心脏、肺脏、肝脏及胫骨等,获得BW(体重),HW(全心重),LVW(左室重),LUW(肺脏重量),LIW(肝脏重量),TL(胫骨长),HW/BW(心体比),HW/TL(心胫比),LVW/TL(左室胫比),LUW/BW(肺体比),LIW/BW(肝体比)等解剖学数据;术后2周取材后行心肌组织HE染色,观察心肌细胞面积大小的变化及微观形态改变情况。实验二成年雄性C57/BL6小鼠,造模方法同实验一,术后分为盐水+假手术组(NS+SHAM组),盐水+TAC组(NS+TAC组),复方罗布麻混悬液+假手术组(LBM+SHAM组),复方罗布麻混悬液+TAC组(LBM+TAC组)四组;术后各组分别予以盐水,复方罗布麻混悬液灌胃处理2周,期间记录小鼠死亡情况及生存状态,如竖毛征,对外界反应,活动度,饮食等;术前、术后1周、术后2周超声心动图检测 AoPg、HR、LVAWd、LVPWd、LVIDd、LVAWs、LVPWs、LVIDs、EDV、ESV,并计算EF%、FS%、LVW等功能学数据;术后2周解剖小鼠心脏、肺脏、肝脏及胫骨等,获得 BW,HW,LVW,LUW,LIW,TL,HW/BW,HW/TL,LVW/TL,LUW/BW,LIW/BW 等解剖学数据;术后2周取材后行心肌组织HE染色,观察统计心肌细胞面积大小的变化情况;并行天狼星红染色观察统计心肌组织纤维化情况。实验三成年雄性C57/BL6小鼠,造模方法同实验一,术后分为NS+SHAM组,NS+TAC组,LBM+SHAM组,LBM+TAC组等四组;术后2周取材提取心肌组织总蛋白及心肌细胞胞核蛋白 Weston Blot 检测 AKT,P-AKT,ERK,P-ERK,GATA4,CaN 及 NFATc3等蛋白的表达。结果实验一1.2组小鼠在2周内实验周期中,TAC组小鼠的生存状态明显差于SHAM组,主要体现在活动减少,反应迟钝,饮食减少,易惊怕生等。2.2周后2组小鼠的超声心动图结果显示:TAC组小鼠较SHAM组小鼠AoPg,LVAWd,LVPWd,LVW,LVW(Corrected)明显加重,差异有统计学意义(P<0.001);EF%,FS%明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);ESV明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。TAC 组小鼠 HR,LVAWs,LVPWs,LVIDd,LVIDs,EDV 相比,差异无统计学意义(P>0.05)。3.2周后2组小鼠的解剖学数据结果显示:TAC组小鼠HW(全心重),LVW(左室重)明显加重,差异有统计学意义(P<0.001);HW/BW(心体比)(P<0.01),HW/TL(心胫比)(P<0.001)及LVW/TL(左室胫比)(P<0.001)明显增加,差异均有统计学意义;TAC组小鼠较SHAM组小鼠HW(体重),TL(胫骨长),2组小鼠基线基本一致;LUW(肺脏重量),LIW(肝脏重量)差异无统计学意义;TAC组小鼠无肺循环充血、无发生左心衰。4.2周后HE染色显示:TAC组小鼠心肌细胞面积明显大于SHAM组,差异有统计学意义(P<0.05)。综上,TAC(主动脉弓缩窄术)后导致小鼠HW(全心重),LVW(左室重)明显加重,HW/BW(心体比),HW/TL(心胫比)及LVW/TL(左室胫比)明显增加;HE染色提示TAC组小鼠心肌细胞明显增大;由此可确定成功制备小鼠压力负荷型心肌肥厚模型。实验二1.生存情况:NS+TAC组生存状态较差,并有部分小鼠死亡;LBM+TAC组较NS+TAC组小鼠状态大部分生存状态稍好仍有部分小鼠死亡;SHAM组(假手术组)起始至观察结束时,状态较好,体重平稳。2.功能学数据:四组小鼠心脏功能学数据显示:NS+TAC组小鼠AoPg(主动脉弓压力阶差)较NS+SHAM组和LBM+SHAM组小鼠明显增加(p<0.001);LBM+TAC组小鼠较NS+SHAM组和LBM+SHAM组小鼠同样增加(p<0.001)LBM+TAC组和NS+TAC组小鼠相比变化无统计学意义(p>0.05)。NS+TAC组小鼠LVAWd(左室前壁舒张期厚度)较NS+SHAM组和LBM+SHAM组小鼠均明显增加(p<0.001);LBM+TAC组小鼠较NS+SHAM组和LBM+SHAM组小鼠同样增加(p<0.001);LBM+TAC组和NS+TAC组小鼠相比LVAWd明显降低(p<0.01)。NS+TAC组小鼠EF%(左室射血分数)较NS+SHAM组和LBM+SHAM组小鼠均降低(p<0.05);LBM+TAC组和NS+TAC组小鼠相比明显升高(p<0.05)。NS+TAC组小鼠FS%(左室短轴缩短率)较NS+SHAM组和LBM+SHAM组小鼠均降低(p<0.05);LBM+TAC 组和 NS+TAC 组小鼠相比升高(p<0.05)。NS+TAC 组小鼠LVW(左心室重量)较NS+SHAM组和LBM+SHAM组小鼠均明显增加(p<0.001);LBM+TAC组小鼠较NS+SHAM组和LBM+SHAM组小鼠同样增加(p<0.05,p<0.01);LBM+TAC组和NS+TAC组小鼠相比明显减少(p<0.01)。NS+TAC组小鼠LVW(Corrected)(左心室校正后重量)较NS+SHAM组和LBM+SHAM组小鼠均明显增加(p<0.001);LBM+TAC组小鼠LVW(Corrected)(左心室校正后重量)较NS+SHAM 组和 LBM+SHAM 组小鼠同样(p<0.05,p<0.01);LBM+TAC 组和 NS+TAC 组小鼠相比明显减少(p<0.01)。此外,四组小鼠HR(心率),LVAWs(收缩末期左室前壁厚度),LVPWd(舒张末期左室后壁厚度),LVPWs(收缩末期左室后壁厚度),LVIDd(舒张末左室内径),LVIDs(收缩末左室内径),EDV(舒张末左室容积)及ESV(收缩末左室容积)均无明显变化(p>0.05);差异均无统计学意义;3.解剖学数据:四组小鼠2周后取材解剖学数据显示,NS+TAC组小鼠HW(全心重),LVW(左室重),LVW/TL(左室胫比)较NS+SHAM和LBM+SHAM明显加重,差异有统计学意义(P<O.001);NS+TAC组小鼠HW/BW(心/体比),HW/TL(心胫比)较NS+SHAM组小鼠明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);较LBM+SHAM组小鼠明显增加,差异有统计学意义(P<0.001);NS+TAC组小鼠HW(全心重),LVW(左室重),HW/BW(心/体比),HW/TL(心胫比),LVW/TL(左室胫比)较LBM +TAC组小鼠明显加重,差异有统计学意义(P<0.01);LBM+TAC组小鼠HW(全心重),LVW(左室重),LVW/TL(左室胫比),HW/TL(心胫比)较LBM+SHAM组小鼠明显加重,差异有统计学意义(P<0.01);LBM+TAC组小鼠HW/BW(心/体比)较LBM +SHAM组小鼠明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。四组小鼠HW(体重),TL(胫骨长)无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),可知四组小鼠基线基本一致。此外,四组小鼠取材LUW(肺脏量)及LIW(肝脏重量)相比差异无统计学意义(P>0.05);这表明2组TAC小鼠无肺循环充血、无发生左心衰。4.HE染色:四组小鼠术后2周后取材行HE染色20倍镜下观察显示,2组TAC小鼠心脏心室壁明显增大,心腔容积变小,呈同心型增厚,NS+TAC组室壁增厚更明显,心腔容积变小更多,LBM+TAC组稍好于NS+TAC组。2组SHAM小鼠心室壁无明显增厚,心腔容积基本正常。行心肌组织HE染色400倍镜下显示,NS+TAC组小鼠心肌细胞面积较NS+SHAM组,LBM+SHAM组及LBM+TAC组小鼠明显增大,差异有统计学意义(P<0.001,P<0.001,P<0.01);LBM+TAC组小鼠心肌细胞面积较NS+SHAM组,LBM+SHAM组小鼠明显增大,差异均有统计学意义(P<0.001)。另在2组TAC小鼠可见心肌间质有增生,细胞间隙明显增大,细胞形态不规则,排列松散,存在细胞溶解,LBM+TAC组较NS+TAC组心肌细胞形态稍好,间质增生少;2组SHAM小鼠心肌细胞形态正常,间质正常,细胞形态规则,排列紧凑,较少发现细胞溶解。5.天狼星红染色:四组小鼠2周后取材行心肌组织天狼星红染色40倍镜下观察心室纤维化显示,2组TAC小鼠心肌组织纤维化程度明显高于2组SHAM组小鼠;TAC小鼠的纤维化以血管为中心,呈放射性。行心肌组织天狼星红染色20倍镜下显示,NS+TAC组小鼠心肌组织纤维化比值较NS+SHAM组,LBM+SHAM组及LBM+TAC组小鼠分别增多明显,差异均有统计学意义(P<0.001);LBM+TAC组小鼠心肌组织纤维化比值较NS+SHAM组,LBM+SHAM组小鼠分别增多明显,差异均有统计学意义(P<0.001)。另2组TAC小鼠心肌组织纤维化高发于血管周围,以血管为中心呈放射性,纤维化好发于心室肌;NS+TAC组小鼠较LBM+TAC纤维化面积更大。6.生存率:四组小鼠2周内分别饲养后死亡率有明显不同,NS+SHAM组和LBM+SHAM组小鼠实验周期内未发生死亡,均正常存活;NS+TAC组小鼠自术后第3天起开始便有死亡发生,第4,10天分别有小鼠死亡,至实验周期结束,总生存率约83.3%;LBM+SHAM组小鼠自术后第6天起开始有死亡发生,此后全部存活,至实验周期结束,总生存率约94.118%;LBM+TAC组小鼠生存率明显高于NS+TAC组。实验三1..P-AKT蛋白的表达:以T-AKT(总AKT)为内参,P-AKT(磷酸化AKT)表达不一致,NS+TAC组表达明显高于其它3组,统计灰度值后,差异有统计学意义(P<0.001),其余三组表达表达略有差异,但无统计学意义(P>0.05)。2.P-ERK蛋白的表达:以T-ERK(总ERK)为内参,P-ERK(磷酸化ERK)表达则不一致,NS+TAC组表达明显高于其它3组,统计灰度值后,差异有统计学意义(P<0.05),其余三组表达略有差异,无统计学意义(P>0.05)。3.GATA4蛋白的表达:以GAPDH为内参,GATA4表达则不一致,NS+TAC组表达明显高于其它3组,统计灰度值后,差异有统计学意义(P<0.05),其余三组蛋白表达略有差异,无统计学意义(P>0.05)。4.CaN蛋白的表达:以GAPDH为内参,CaN表达则不一致,NS+TAC组表达明显高于NS+SHAM和LBM+SHAM组,统计灰度值后,差异有统计学意义(P<0.001),高于LBM+TAC组,统计灰度值后,差异有统计学意义(P<0.05);LBM+TAC组CaN表达量高于LBM+SHAM组,差异有统计学意义(P<0.05),高于NS+SHAM组,差异有统计学意义(P<0.01);其余2组蛋白表达略有差异,无统计学意义(P>0.05)。5.NFATc3蛋白的表达:以TUBLIN为内参,NFATc3表达则不一致,NS+TAC组表达明显高于其它3组,统计灰度值后,差异有统计学意义(P<0.01),LBM+TAC组NFATc3表达明显高于NS+SHAM组和LBM+SHAM组,差异有统计学意义(P<0.001),NS+SHAM组和LBM+SHAM组蛋白表达略有差异,无统计学意义(P>0.05);LBM+TAC组NFATc3蛋白表达较NS+TAC组小鼠有降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.本实验成功复制TAC(主动脉弓缩窄)致C56/BL6小鼠心肌肥厚模型。2.四组小鼠在实验结束后,LBM+TAC组较NS+TAC组生存质量明显改善,死亡率明显降低,心脏功能学改善,解剖学数据好转,心肌组织HE染色心肌细胞面积缩小,天狼星红染色显示纤维化比值减低。3.复方罗布麻片通过抑制AKT-P-AKT-GATA4和ERK-P-ERK-GATA4通路发挥抑制心肌肥厚的作用,通过抑制CaN表达,抑制NFATc3去磷酸化发挥抑制心肌肥厚的作用。