背景:创伤修复一直是医学领域的研究热点。随着全球经济的快速发展,社会冲突、交通事故频发、动物的撕咬、手术造成的创伤、人口老龄化加快等,均致使创伤发病率和死亡率高居不下,且创伤治疗过程中消耗大量的精力及经济损失,给个人和社会都造成巨大的负担。随着现代创伤修复研究地深入及治疗技术的进步,创面愈合速度显著加快,但同时也产生了一系列问题。创面愈合一个重要并发症是瘢痕形成,这不仅严重影响患者美观,对患者心理也产生了严重影响。因此寻找将愈合速度及质量并重,适当调控愈合速度,使肉芽生长与再上皮化同步进行的创伤修复药物是一个长期而必要的举措。中医药对如何促进创面修复有着独特的理解和丰富的临床经验,地龙就屡有作为传统经方治疗烧烫伤等创面损伤的临床报道。课题组前期研究发现断体三天的赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)提取液含有促进创伤愈合的活性物质,并经过多步活性追踪分离,得到了具有显著创伤修复作用的蛋白条带,鉴定得到24种蛋白,且初步探究了断体地龙促进细胞增殖的作用通路。目的:本课题拟在前期研究成果基础上继续探究断体地龙促创面修复作用与Ras/Raf/MEK/Erk信号通路关系,探索断体地龙对于创面愈合质量的影响,并建立ICP-MS法研究断体地龙促创面愈合作用与无机元素间的关系。方法:(1)采用SYBR实时荧光定量PCR法检测断体地龙活性蛋白(13)对NIH3T3细胞MAPK/Erk信号通路中K-Ras、B-Raf、Raf-1和Erk1/2基因mRNA表达影响。采用Western blot方法检测I3对NIH3T3细胞和Wistar大鼠皮肤创伤组织Ras/Raf/MEK/Erk信号通路中K-Ras、B-Raf、Raf-1和Erk1/2蛋白含量的影响。(2)建立大鼠皮肤急性创伤模型,通过大体观察、测定皮肤愈合率以评价I3对大鼠创面组织愈合速度的影响。于术后7 d、14 d和21 d采用HE、Masson等组织学染色方法及测定羟脯氨酸(HYP)的含量评价Wistar大鼠皮肤创伤组织病理形态及胶原纤维的改变。采用免疫组化方法测定断体地龙对大鼠皮肤创伤组织中PDGF、TGF-β表达含量。(3)建立ICP-MS法测定大鼠皮肤创伤组织中金属元素的含量变化。结果:(1)SYBR实时荧光定量PCR结果显示断体地龙组(DT)较于空白对照组Raf-1、Erk1及Erk2基因mRNA表达显著性增加。Western blot实验结果表明,DT组明显提高NIH3T3细胞Ras/Raf/MEK/Erk通路中Erk1/2蛋白表达,各DT组可显著增加Erk2蛋白表达。(2)在21天实验周期内,大鼠术后活动状况正常,各组大鼠在21天左右皮肤基本愈合,相较于空白对照组,DT组创面较平整、柔软,形成结痂面积较小。造模后第0～14天,DT组大鼠皮肤愈合率明显提高,术后21天愈合率可达98%。HE染色观察结果显示,第7 d到第14 d,各组均有不同程度的愈合,相较于空白对照组及未断体(WDT)组,DT组皮肤结构完整,真皮层中可见较多的毛细血管分布;第21天各处理组表皮层均有完整的表皮覆盖,DT组大鼠皮肤创面可见较薄的表皮层、较多新生毛细血管及胶原纤维排列较规则。Masson染色结果显示,DT组相对于空白对照组和WDT组大鼠受伤皮肤真皮层胶原纤维所在区域及数量显著增多,且胶原纤维排列平行紧密。在造模后第7、14和21 d,空白对照组I、III型胶原数量比值保持基本不变,术后14～21 d DT组较空白对照组有更多的胶原纤维被染成亮绿色,且亮度明显。测定皮肤组织HYP含量结果显示,术后7天和14天,DT组HYP含量显著高于空白对照组及WDT组(P<0.05)。术后第21天,空白对照组HYP含量高于正常大鼠皮肤组织,WDT及DT组大鼠皮肤组织中的HYP含量显著低于空白对照组(P<0.05),DT组HYP含量与正常大鼠皮肤组织中HYP含量更加接近。免疫组化结果显示,各组PDGF、TGF-β含量均是造模后第7天最高,之后逐渐降低。与空白对照组相比,WDT及DT组第7天PDGF和TGF-β均显著提高(P<0.01)。第14到21天,WDT及DT组PDGF、TGF-β分泌明显减少(P<0.01),且明显低于空白对照组。(3)采用建立的ICP-MS法测定大鼠皮肤组织中无机元素,结果显示,在优化的实验条件下,各元素在0μg/L～250μg/L范围内具有良好的线性(r≥0.999);方法的检出限(3σ,n=10)为 0.02μg/L～13.04μg/L;加样回收率(n=6)为 85.4%～119.0%。样品测定结果显示,DT组较模型组可显著提高创面皮肤钾钙镁大量元素含量和锌铁铜等微量元素的含量,且有害重金属含量低于国家限量标准。结论:(1)结合实时荧光定量PCR和Western blot实验结果可知I3促创伤愈合作用与调控Ras/Raf/MEK/Erk信号通路相关,主要提高Erk2表达。且发现DT组中,中剂量组对各基因表达均有明显的促进作用,因此推测断体地龙调控Ras/Raf/MEK/Erk信号通路基因表达在一定浓度范围内具有剂量依赖性。(2)组织学观察结果表明I3可加速创伤组织愈合,促进胶原纤维蛋白和新生血管形成。I3在创伤愈合中期提高PDGF、TGF-β含量,从而促进细胞增殖和肉芽组织生长,在创面愈合阶段的后期可降低PDGF、TGF-β的分泌防止胶原纤维代谢异常,造成胶原沉积而预防瘢痕产生。创面修复过程中,13不会持续增加HYP含量,并可增加Ⅲ型胶原纤维数量,表明断体地龙可能有预防瘢痕产生的作用,具有更好的愈合质量。(3)建立ICP-MS方法测定大鼠创面皮肤中无机元素含量,经方法学考察表明此法简便快速、准确性好且灵敏度高,可同时测定大鼠创面皮肤中多种无机元素的含量。断体地龙发挥促创面愈合作用与提高创面组织中金属元素相关,保证皮肤创伤部位各金属元素在较高水平有利于抑制成纤维细胞的过度增生,从而有利于预防瘢痕的产生,并且不会提高有毒重金属元素的含量,具有极高的安全性。