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钠泵(Na+,K+-ATPase)是哺乳动物细胞膜上普遍存在的一种离子泵,它在维持体内电解质平衡、稳定细胞膜电位、信号转导等方面具有重要作用。钠泵由α、β、γ三个亚单位组成,其中α亚单位具有酶的活性和许多钠泵调节因子的结合位点。α亚单位有α1、α2、α3、α4四种亚型,各亚型的基本结构高度保守,有10个跨膜区(M1-M10),其中M1-M2、M3-M4、M5-M6、M7-M8、M9-M10间的序列位于细胞膜外,称为膜外区,含有多种配体结合位点,如内源性钠泵抑制因子哇巴因通过这些位点与细胞膜上的钠泵结合,并通过一系列生物学作用导致血压升高。目前认为钠泵α亚基的第一个膜外区M1-M2是重要的钠泵抑制因子哇巴因的结合位点。然而,哇巴因到底是如何与钠泵发生相互作用的,如果用特异性结合短肽封闭这个位点,能否解除哇巴因对钠泵活性的抑制作用,从而达到治疗高血压的目的,迄今为止尚未有人尝试。因此本研究拟筛选钠泵α1亚基M1-M2膜外区特异性结合肽,以阻断或拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用,为进一步探讨钠泵与其抑制因子的可能作用机制及高血压的治疗奠定基础。一、钠泵α1亚基M1-M2膜外区蛋白的克隆和表达目的:利用基因重组技术构建钠泵α1亚基M1-M2膜外区蛋白的表达载体,通过诱导表达获得蛋白,为随机肽库筛选实验提供靶分子。方法:(1)钠泵α1亚基M1-M2克隆载体的构建。以质粒YhNα1(含人钠泵α1亚基cDNA序列)为模板,PCR扩增得到α1亚基的2个基因片段:T1T2,T1T2D,其中T1T2含α1亚基N端至M2碱基序列,T1T2D含α1亚基N端至M1碱基序列。分别将其加尾后连接至克隆载体pGM-T并转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,得到质粒pGMT-T1T2,pGMT-T1T2D。测序验证基因序列是否与理论结果一致。(2)钠泵α1亚基M1-M2蛋白表达体系的构建。分别从T载体质粒上切下目的基因片段,双酶切连接到表达载体pET32a(+)上并转化入大肠杆菌Rosetta2,挑选阳性克隆,得到质粒pET32a(+)-T1T2,pET32a(+)-T1T2D。双酶切验证目的基因序列是否正确。1%接种表达菌,用终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达。结果:(1)以质粒YhNα1为模板进行PCR扩增得到基因片段T1T2,T1T2D,产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,在相应的位置出现明显的条带,说明基因片段扩增成功。将其加尾后连接至pGM-T载体并转化入大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆扩增并提取质粒,双酶切和测序结果显示基因序列与理论一致。(2)分别将目的基因片段与同样双酶切的pET32a(+)表达载体相连,转化Rosetta2感受态细胞,在含Amp的平板上筛选重组子。双酶切结果表明蛋白表达体系构建成功。(3)通过IPTG诱导,分别在大肠杆菌Rosetta2中表达T1T2和T1T2D融合蛋白。SDS-PAGE结果表明,T1T2D目的条带与理论值一致,而T1T2目的条带未表达。结论:利用基因工程的手段成功构建了T1T2与T1T2D的克隆载体和表达载体。T1T2D融合蛋白表达成功,但T1T2融合蛋白没有表达,推测可能由于T1T2片段包含跨膜区的氨基酸序列,导致疏水性过强所致。二、钠泵α1亚基M1-M2膜外区特异性结合肽的筛选目的:以人工合成的钠泵α1亚基M1-M2膜外区蛋白为靶标,通过噬菌体随机肽库(phage random peptide library)技术筛选能与之特异性结合的多肽,以阻断或拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用,为进一步探讨钠泵与其抑制因子的可能作用机制及高血压的治疗奠定基础。方法:(1)采用固相筛选法,从噬菌体随机12肽库淘选特异性结合肽。以人工合成的钠泵α1亚基M1-M2多肽(ATEEEPQNDNLGGGS)作为靶分子,通过三轮“吸附-洗脱-吸附”的淘选,使能与靶蛋白结合的噬菌体展示多肽得到富集。(2)双夹心ELISA鉴定噬菌体阳性克隆:以钠泵α1亚基M1-M2膜外区多肽(ATEEEPQNDNLGGGS)包被ELISA板,同时设置阴性对照,将噬菌体克隆扩增后加入板中,加入HRP-抗M-13抗体,显色后于420 nm测定OD值。(3)浓度依赖性实验:以钠泵α1亚基M1-M2膜外区多肽(ATEEEPQNDNLGGGS)为靶蛋白,每个待鉴定克隆包被一排孔,将噬菌体克隆扩增后测定滴度,加入~1012 pfu的噬菌体并进行5倍系列稀释,加入HRP-抗M-13抗体,显色后测定OD值,以稀释倍数对吸光度作图,观察噬菌体克隆结合力与浓度的关系。(4)M-13噬菌体ssDNA的提取及序列分析:从第三轮筛选的平板上随机选取噬菌体蓝斑,以E.coli ER2738为宿主菌经扩增得到噬菌体原种上清,用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体,以NaI/乙醇溶液提取出ssDNA。测序后,参照M-13噬菌体的基因序列,找到外插片段的位置,对照噬菌体展示12肽库试剂盒说明书的“遗传密码表”推导出其对应的氨基酸序列。(5)哇巴因竞争性抑制试验:以钠泵α1亚基M1-M2膜外区多肽(ATEEEPQN DNLGGGS)包被96孔板,浓度为80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml的哇巴因溶液与噬菌体上清1:1混合后,加入96孔板,测定OD值,计算抑制率,观察噬菌体展示肽对哇巴因的竞争性抑制作用。结果:(1)噬菌体展示12肽库筛选结果:通过每轮筛选的产出量和投入量之比,可以看出噬菌体的回收率逐渐升高,有较明显的富集效果。(2)双夹心ELISA实验:通过对比实验孔和阴性孔的OD值,从随机挑取的噬菌体单克隆中鉴定出9个符合要求的噬菌体阳性克隆。(3)浓度依赖性试验:对双夹心ELISA实验筛选出的9个噬菌体克隆进行亲合力的浓度依赖性试验,以稀释倍数对吸光度作图。结果显示,只有4个噬菌体克隆符合要求。(4)提取噬菌体阳性克隆的ssDNA,进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,目的条带与M-13噬菌体DNA大小相符。序列测定结果表明,4个阳性噬菌体克隆展示肽的氨基酸序列完全一致,均为:WHWRNPDFWYLK。(5)哇巴因竞争性抑制试验:结果显示,随着哇巴因的减少,其对噬菌体展示肽的抑制率也随之降低。说明获得的噬菌体展示肽可以和M1-M2膜外区蛋白特异性结合,并且对哇巴因有竞争性拮抗作用。结论:利用人工合成的M1-M2膜外区多肽,从噬菌体随机十二肽库中成功获得了能够与其特异性结合,并竞争性抑制哇巴因与钠泵结合的噬菌体展示多肽(WHWRNPDFWYLK)。为进一步探讨钠泵与其抑制因子的可能作用机制及高血压的治疗奠定了基础。