论文部分内容阅读
在食源性致病菌的检测中,利用多重PCR扩增存在效率不均衡的问题,通过提高检测效率,并检测通量,拟建立起金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和大肠埃希氏菌0157等五种食源性致病菌的检测方法,即简便、灵敏的Tem-PCP-DHPLC的高通量检测方法。本研究根据GenBank公布的5种致病菌的特异性靶基因序列,设计出金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌三种菌的复合引物,经靶序列富集多重PCR (Tem-PCR)扩增过程中特异性长引物浓度优化,最佳反应浓度为80 nmol/L.对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌等三种菌的检测过程中,采用三步Tem-PCR扩增步骤,进行扩增,其检测灵敏度分别为2×103 cfu/mL、1.2×103 cfu/mL和1.1×103 cfu/mL,与传统多重PCR灵敏度相当。以此建立的Tem-PCR方法检测金黄色葡萄球菌等37种致病菌种,证明该方法具有良好的检测特异性。对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和沙门氏菌随机组合污染的模拟食品样品、对照样品进行检测,具有良好的实用性。根据5种菌的靶基因序列设计了金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌0157五种菌的复合引物,在Tem-PCR的反应体系和条件下,对此五种菌分别经过三至五重扩增,结果表明5种致病菌皆能有效扩增,将五种菌的扩增产物经变性高效液相色谱(DHPLC)检测,得到吸收峰。金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为620 cfu/mL,其余都小于100 cfu/mL,表明五种食源性致病菌的检测灵敏度较高。用Tem-PCR-DHPLC方法对实验样品进行检测,结果显示,该方法能够准确检测出污染组样品中的致病菌,与国家标准方法检测结果相符合。显示了该方法的良好适用性。Tem-PCR、Tem-PCR-DHPLC检测方法,相比传统多重PCR方法,能有效地解决PCR扩增过程中由引物浓度而引起的扩增效率不均衡的问题,不需优化引物浓度,方法特异性强,灵敏度高,具有较好的实用性。