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脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)是一类重要的工业酶制剂,可以催化酯化、转酯化、水解、醇解等多种反应,被广泛用于生物燃料、食品加工、营养品、化妆品、医药等领域。本实验室所培育的解脂耶氏酵母(Yarrowia liploytica)含有多个脂肪酶基因,其所生产的混合脂肪酶已成功应用于生物柴油、多元醇酯等产品的合成中。为细化对解脂耶氏酵母脂肪酶家族的了解,扩展其脂肪酶应用范围,论文以解脂耶氏酵母胞外脂肪酶为研究重点,对Lip2、Lip7、Lip8三个脂肪酶进行异源表达及酶学性质基础理论研究,为后续解脂耶氏酵母脂肪酶家族应用奠定基础。本论文主要进行如下工作：(1)成功构建pPICZaA-lip2、pPICZaA-lip7、pPICZaA-lip8三个重组质粒,并在毕赤酵母GS115中成功实现Lip2、Lip7、Lip8的分泌表达。优化了摇瓶阶段发酵条件,在诱导温度为25℃、诱导时间为72 h的发酵条件下,三个脂肪酶的水解酶活(对硝基苯酚棕榈酸酯法)最佳,分别是3.38 U/mL、0.18U/mL、0.05 U/mL。(2)本论文系统对比解脂耶氏酵母三个胞外脂肪酶催化能力,对毕赤酵母体系表达的脂肪酶进行相关酶学性质的研究。Lip2、Lip7、Lip8的5L发酵罐发酵液的水解酶活分别为4000 U/mL、4.12U/mL、1.71 U/mL, Lip2的水解活性优于Lip7和Lip8。酶学性质的基础研究显示：Lip2、Lip7、 Lip8最适pH均为8.0；最适温度分别为40℃、40℃、50℃,论文从氨基酸组成上解释了Lip8嗜热的原因；不同金属离子对三个脂肪酶活性的抑制或促进程度不同,其中Ni2+抑制作用最为明显；Lip2偏向水解长链酯,而Lip7和Lip8偏向水解中链酯,并从空间结构解释脂肪酶底物特异性存在差异的原因。以上性质上的差异,为后续三个脂肪酶的进一步研究和应用奠定基础。(3)由于大肠杆菌具有发酵周期短、培育成本低的优势,本文对脂肪酶在大肠杆菌中的异源表达进行初步探究。成功构建pET22b-lip7重组质粒,并在大肠杆菌体系中实现解脂耶氏酵母脂肪酶Lip7的异源表达。优化了摇瓶阶段发酵条件：在诱导时间为12 h,表达宿主为Rosetta,诱导温度为20℃的发酵条件下,Lip7的水解酶活最佳,为0.29 U/mL。(4)解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2作为一种具有广泛应用价值的脂肪酶,其热稳定性较差,阻碍其应用。本论文在实验室前期改造基础上,尝试进一步提高Lip2的热稳定性。通过定点突变技术,成功构建Lip2三个突变子T117G/C244A、F237C/C244A、T117G/F237C/C244A,并在毕赤酵母GS115中成功实现分泌表达。最终突变酶T117G/F237C/C244A的热稳定性最佳,在50℃下的半衰期大于100 min,相较于本实验室前期改造的Lip2突变酶(14.4 mmin),进一步提高了Lip2的热稳定性。通过对脂肪酶空间结构的分析,探讨了突变酶热稳定性提高的机制,为深入了解解脂耶氏酵母脂肪酶家族结构与功能的关系提供了理论基础。