研究背景脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一类严重的中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤。流行病学研究表明,此类损伤多见于男性青壮年,最常发生于16-30岁的年轻人,车祸(40.4%)及高处坠落伤(27.9%)。脊髓损伤常造成患者生活质量严重下降,严重影响患者对生命的预期。在临床上,脊髓损伤呈现高发生率、高致残率、高耗费和低龄化的特点。为治疗SCI人们进行许多有益的探索,但至今,效果并不理想。急性SCI包括原发性和继发性两种损伤机制。原发性损伤是指受伤时由于椎骨的移位、脱位或者椎间盘突入椎管压迫脊髓或者骨折碎片刺伤脊髓而造成的脊髓的压迫和冲击,常引起脊髓的撕裂、挫裂及剪切,原发性损伤是在受伤当时即由外力产生,是不可逆的损伤。继发性损伤是在原发性损伤之后,由一系列的生物反应机制介导的复杂反应过程,常造成脊髓损害的进一步加重,其所产生的脊髓损害程度有时甚至超过了原发性损伤。继发性损伤的病理机制极为复杂,涉及到多种因素,且这些因素之间相互影响,交互作用,结果使最初病灶周围原来完整的组织发生自身破坏性病变。目前对继发性脊髓损伤的研究主要集中在以下的方面：损伤局部缺血缺氧、微循环改变,脊髓缺血后延迟性低灌注,免疫炎症反应,自由基反应及脂质过氧化等等。随着对SCI病理生理机制研究的深入,人们认识到脊髓损伤后的兴奋性氨基酸(EAAs)中毒起重要作用。在中枢神经系统内,兴奋性氨基酸(EAAs)神经递质主要包括谷氨酸(西u)和天门冬氨酸(Asp)。正常情况下它们存在于神经末梢的囊泡中,当神经冲动传达到神经末梢,引起神经末梢去极化时,通过Ca2+依赖方式间断地释放EAAs。释放入神经间隙的EAAs通过作用于特异性膜受体,引起一系列细胞第二信使的变化,从而将信息进一步往下传导。其本身则在内因酶的降解及重摄取过程中从突触迅速消除。EAAs在继发性脊髓损伤的神经毒素作用主要表现在两方面：一是在损伤后数小时内介导EAAs受体过度兴奋引起神经细胞急性渗透性肿胀,以Na+内流和CI-及水被动内流为特征；二是在损伤后数小时至数日内介导NMDAR过度兴奋所引起的神经细胞延迟性损伤,以Ca2+内流为特征,引起细胞内Ca2+超负荷,一方面可抑制线粒体生物氧化功能,ATP生成减少,加速磷脂酶降解,促进蛋白质溶解而直接引起神经细胞变性坏死；另一方面胞内钙超载,可产生大量的自由基,引发氧化应激反应。自由基化学性质活泼,氧化作用极强,严重破坏细胞膜正常结构,激活半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶家族(caspases),引起一系列酶的联级反应,最终导致细胞凋亡发生。SCI后轴突脱髓鞘,是脊髓损伤后另外一个重要的损伤机制,在脊髓损伤中也扮演着重要的作用。在中枢神经系统内,链鞘是由少突胶质细胞形成的包绕轴突的重要结构,轴突髓鞘化后,传导速度增加近100倍,有利于完成各种精细复杂的信息交流。同时,轴突髓鞘化后,有髓神经纤维保持跳跃式传导,节约了大量能量。而且,完整的髓鞘能限制谷氨酸盐及CD8+T细胞等对轴突的攻击。近年来的研究越发重视脊髓损伤后髓鞘及少突胶质细胞在神经修复中的作用。因此,寻求一种有效促进髓鞘组织再生的方法是脊髓损伤治疗的关键。然而,临床尚无促髓鞘形成的有效方法。目前NMDAR拮抗剂已被广泛应用在CNS损害所致神经元损伤。NMDAR离子通道的阻滞剂如氯胺酮、苯环已呱啶(phencyclidine)及MK-801能防止Ca2+进入细胞,避免胞内Ca2+超载及兴奋性毒性。NMDAR被用作治疗CNS损害的靶器,在急性SCI也有类似治疗作用机制。对脊髓损伤应用NMDAR拮抗剂(CPP)鞘内注射能有效地减轻神经功能和组织的损害,拮抗Na+、Ca2+内流,既可减轻神经细胞的损害,又可争取时间进行其他治疗。美金刚(memantine)是一种新型的具有低中度亲和力、电压依赖、非竞争性的NMDA(N-methy-D-aspastate)受体拮抗剂。化学名为1-氨基-3,5二甲基金刚烷胺,分子式为C12H21N·HC1,其相对分子质量为215.76,为纯白色或者白色粉末,溶于水。其最早是用于治疗中、重度的阿尔茨海默病(AD),随着研究的深入,美金刚逐渐用于其他疾病的治疗。美金刚作为NMDAR阻断剂,能有效阻断谷氨酸盐与其离子通道型受体的结合,减轻谷氨酸(Glu)病理性浓度升高导致的神经元损伤。美金刚在NMDAR中的结合位点与M矿有重叠,但与Mg2+不同,它与NMDAR的亲和力较低,使其结合后容易从受体中解离出来。另外美金刚具有电压依赖性,正常生理活动时,由于突触后膜的强烈去极化,使其从受体中解离出来,但在持续时间较长的中等程度的去极化时,比如在发生损伤时,美金刚仍将继续留在受体中,发挥封闭作用。少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)是一类来源于胚胎发育早期神经管腹侧神经上皮细胞,广泛分布于动物的中枢神经系统。少突胶质前体细胞作为成熟少突胶质细胞(OL)的祖细胞,能在多种因子的作用下迁移、分化为成熟的少突胶质细胞,参与中枢神经系统轴突髓鞘的形成,其较其他来源的干细胞有明显优势,OPCs移植是治疗脊髓损伤理想的细胞来源。鉴于研究已经证实OPCs中有NMDAR功能性表达,NMDAR介导的Ca2+内流也是脊髓损伤后OPCs死亡的主要机制。因此,本研究通过美金刚联合OPCs移植治疗脊髓损伤大鼠,一方面探讨美金刚能否阻断谷氨酸盐兴奋性中毒,减轻NMDAR的过度激活介导的氧化应激反应对脊髓的破坏；另一方面,探讨美金刚能否通过阻断谷氨酸盐对移植的OPCs的损伤,减少移植OPCs的死亡,促进移植细胞的存活与分化,更好发挥其髓鞘再生的功能。这将为脊髓损伤的治疗提供新思路。目的1、研究美金刚对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的影响及相关作用机制。2、通过美金刚联合OPCs移植治疗脊髓损伤大鼠,观察大鼠运动功能恢复,探讨损伤脊髓的氧化应激状态的变化及OPCs的存活与分化、轴突髓鞘再生情况。方法1、80只健康成年雄性SD大鼠,采用钳夹法建立大鼠T12脊髓损伤动物模型,并随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、美金刚组(C组)及MK-801组(D组),每组20只。术前及术后24h、72h、5d、7d进行运动功能BBB评分,并采用黄嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸法检测损伤脊髓节段组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平；HE、尼氏染色观察损伤脊髓组织的病理学改变及Tunel法检测神经细胞的凋亡。2、原代培养获取足够数量的OPCs,并采用免疫荧光标记OPCs特异性抗体04进行鉴定。取健康成年雄性SD大鼠100只,采用钳夹法损伤大鼠T12脊髓节段,建立脊髓损伤动物模型,并随机分为模型组(A组)、PBS组(B组)、美金刚组(C组)、OPCs组(D组)、MEM+OPCs组(E组),每组20只。在完成美金刚注射后第1d、3d、5d、7d,每组大鼠各取5只取损伤段脊髓组织进行匀浆,进行SOD及MDA检测。造模完成后7天于损伤原位行OPCs移植。细胞移植后每周进行BBB评分,观察后肢的运动功能恢复；细胞移植后8周,进行免疫荧光双标记观察OPCs的存活与分化以及大鼠的髓鞘再生。结果1、脊髓损伤模型的建立实验过程中在动脉血管夹突然钳夹大鼠脊髓瞬间,大鼠尾巴出现短暂的连续性痉挛性摆动,双下肢短暂性连续性回缩样扑动,随后双下肢驰缓性瘫痪。钳夹脊髓处可见缺血暗区、水肿。脊髓损伤实验动物模型建立成功。2、少突胶质前体细胞(OPCs)的培养及鉴定原代培养第1天混合胶质细胞开始贴壁,第2天可见细胞成团贴壁生长,呈小圆形、卵圆形和多角形,第8-9天时可见明显的细胞分层现象,下层为融合成片的、铺满培养瓶底的星形胶质细胞,上层为紧密贴附在星形胶质细胞表面的OPCs, OPCs胞体呈小圆形、折光性较强,部分细胞伸出1、2个突起。通过振荡分离和差速贴壁等方法分离获得大量的OPCs,行OPCs免疫细胞化学检测鉴定,大部分细胞04抗体阳性。3、运动功能评分在第一部分实验中,美金刚干预组和MK-801干预组与模型组相比,大鼠后肢运动功能BBB评分显著增加,各时间点差异均具有统计学意义俨<0.05),但美金刚干预组与MK-801干预组在各个时间点BBB评分相比较差异无统计学意义(P>0.05)。在第二部分实验中,各实验组大鼠后肢运动功能BBB评分都随着时间延长,评分逐渐增加,美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组在各时间点上与模型组及PBS干预组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4、SOD、MDA检测在第一部分实验中,术后第1天各损伤组大鼠SOD值较假手术组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)；采用美金刚及MK-801干预72 h、5 d、7 d后,SOD水平逐渐上升,与模型组相比,差异显著(P<0.05),但第7d时,美金刚干预组、MK-801干预组与假手术组相比,SOD变化无显著性差异。美金刚干预组与MK-801干预组在各个时间点SOD值差异无统计学意义(P>0.05)。术后美金刚干预组、MK-801干预组MDA值逐渐下降,与模型组相比,各时间点MDA含量均具有显著性差异(P<0.05)。在第二部分实验中,SOD水平在模型组及PBS干预组中随着时间延长,SOD值逐渐降低；美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组SOD水平随着时间延长,SOD值逐渐升高,美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组在各时间点上与模型组及P3S干预组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。术后美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组MDA值逐渐下降,与模型组及PBS干预组相比,各时间点MDA含量均具有显著性差异(P<0.05)。5、HE、尼氏染色HE染色及尼氏染色结果发现假手术组各时间点大鼠脊髓组织结构未见明显异常；模型组脊髓组织灰质内可见大量出血灶,白质结构紊乱、出现空洞,灰白质交界不清楚,神经纤维排列疏松,神经细胞肿胀,间质可见炎性细胞浸润；美金刚干预组脊髓组织内也可见小量出血灶,细胞轻度肿胀,间质少量炎症细胞浸润；MK-801干预组脊髓组织内神经细胞轻度肿胀,神经纤维轻度疏松。尼氏染色可见模型组神经元、神经胶质细胞内尼氏体淡染、数量明显减少甚至消失,美金刚及MK-801干预组尼氏体结构规则,数量较假手术组稍减少。6、TUNEL细胞凋亡检测TUNEL法检测结果发现,术后第1天各损伤组大鼠神经凋亡细胞率较假手术组明显升高,差异有统计学意义(P>0.05)；随后各时间点美金刚干预组及MK-801干预组神经细胞凋亡率逐渐降低,3d、5d、7d较模型组差异有统计学意义(P<0.05),美金刚干预组与MK-801干预组在各个时间点神经细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。7、免疫荧光双标记观察OPCs的存活与分化镜下观察,CC1为成熟少突胶质细胞的标记物,在镜下被激发出红光,NG2为OPCs的标记物,在镜下被激发出绿光。美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组均可见到明显红光和绿光信号,联合干预组的阳性信号较其他组更为明显。8、免疫荧光双标记观察髓鞘的再生镜下观察,MBP为髓鞘的特异性标志物,在镜下被激发出黄光,NFM为轴突特异性标志物,在镜下被激发出绿光,各实验组均可见到髓鞘再生的荧光信号,美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组的髓鞘再生较模型组更为明显。9、统计学分析结论美金刚可以通过拮抗兴奋性谷氨酸盐毒性作用阻断过度激活的NMDAR功能,减轻大鼠脊髓损伤后氧化应激反应,减少脊髓损伤处神经细胞的凋亡,促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。美金刚联合少突胶质前体细胞(OPCs)移植治疗大鼠脊髓损伤,能有效地促进移植的少突胶质前体细胞存活与分化,促进髓鞘再生。