论文部分内容阅读
目的:本实验旨在探索青蒿琥酯抑制大鼠肺纤维化的作用机制,探讨NOTCH1信号通路在青蒿琥酯抗肺纤维化中的意义,为临床上治疗肺纤维化提供新的思路。方法:实验分为细胞水平及整体水平两部分,第一部分研究青蒿琥酯对原代肺成纤维细胞分化过程中NOTCH1通路的影响。第二部分观察青蒿琥酯对大鼠肺纤维化中NOTCH1通路的影响。第一部分:采用酶消化法与组织贴块法相结合的方式,从出生1-7天的SD大鼠肺组织中提取原代肺成纤维细胞,利用细胞贴壁时间差异性纯化细胞,经波形蛋白(vimentin)免疫荧光检测细胞纯度后,无血清培养基培养24小时(h)将细胞同步化,再将其随机分为5组,(1)对照组:无特殊处理,无血清培养基培养;(2)青蒿琥酯对照组:加入含8μg/ml青蒿琥酯培养基培养;(3)TGF-β1诱导组:加入含5ng/ml TGF-β1培养基诱导培养;(4)NOTCH信号通路抑制剂(DAPT)组:加入含5ng/ml TGF-β1与10μmol/L DAPT的培养基培养;(5)青蒿琥酯干预组:加入5ng/ml TGF-β1与8μg/ml青蒿琥酯培养基培养。培养24h后Western blot检测Notch1、Jagged1、NICD、Hes-1、α-SMA蛋白的表达。培养48h后检测各组细胞培养液中胶原的表达量。免疫荧光检测各组细胞细胞核内NICD的表达。第二部分:雄性SD大鼠24只,随机分为四组,对照组、青蒿琥酯组、模型组和青蒿琥酯干预组各6只。(1)对照组:第1天气管内滴入生理盐水约0.3ml,第2天始每只大鼠每日腹腔注射生理盐水1ml,共计28天。(2)青蒿琥酯对照组:第1天气管内滴入生理盐水约0.3ml,第2天始每只大鼠每日腹腔注射青蒿琥酯10mg/100g,共计28天。(3)模型组:第1天气管内滴入博莱霉素5mg/kg,第2天始每只大鼠每日腹腔注射生理盐水1ml,共计28天。(4)青蒿琥酯干预组:第1天气管内滴入博莱霉素5mg/kg,第2天始每只大鼠每日腹腔注射青蒿琥酯10mg/100g,共计28天。上述各组大鼠于第28天处死。取肺组织进行HE染色、Masson染色,进行Jagged1、NICD、Hes-1、α-SMA及Ⅳ型胶原的免疫组化染色。Western blot检测各组肺组织中Notch1、Jagged1、NICD、Hes1、α-SMA蛋白的表达。结果:一、(1)免疫荧光检测vimentin结果示:在酶消化与贴块法提取的细胞中vimentin高表达。(2)免疫荧光检测α-SMA表达及Masson染色结果表明,TGF-β1诱导组的细胞较对照组α-SMA的表达明显,且蓝色沉积增多。(3)Western blot结果显示青蒿琥酯干预组细胞中Notch1、Jagged1、NICD、Hes-1、α-SMA蛋白的表达明显低于TGF-β1诱导组,p值小于0.05。(4)各组细胞总胶原分泌检测结果示:青蒿琥酯干预组细胞分泌的总胶原较TGF-β1诱导组明显降低,p值均小于0.05。(5)免疫荧光检测NICD结果表明,青蒿琥酯干预组细胞核及细胞浆中NICD的表达较TGFβ1诱导组明显降低。二、(1)HE染色和Masson染色显示,与对照组相比,模型组肺泡结构明显破坏,肺泡间隙出现大量细胞外基质及胶原沉积,大范围的肺组织纤维化。青蒿琥酯干预组较模型组减轻。(2)免疫组化染色表明,青蒿琥酯干预组肺组织中NICD、Jagged1、Hes-1、IV型胶原及α-SMA的表达明显低于模型组。(3)Western blot结果显示青蒿琥酯干预组肺组织中Notch1、Jaged1、NICD、Hes-1、α-SMA蛋白的表达显著低于模型组,p值均小于0.05。结论:1.青蒿琥酯抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞中α-SMA及胶原的表达,抑制其分化成肌成纤维细胞;2.青蒿琥酯抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞中Jagged1、Notch1、NICD及Hes-1的表达。3.青蒿琥酯抑制博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化肺组织中Jagged1、Notch1、NICD及Hes-1的表达,同时抑制胶原及α-SMA的表达。4.青蒿琥酯能减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化,其机制可能是阻断肺纤维化中NOTCH1通路活性。