pEGFP-PTEN的构建及其在子宫内膜癌细胞HEC-1B中的表达

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目的:采用基因同源重组技术,构建携带外源性野生型PTEN基因的重组pEGFP质粒,将外源性PTEN基因导入子宫内膜癌细胞HEC-1B中,观察外源性野生型PTEN对HEC-1B细胞增殖的影响,为子宫内膜癌的基因治疗提供理论基础。方法:应用RT-PCR方法从正常人胚肾细胞293T中获得PTEN片段,应用基因重组技术先克隆至pMD18-T载体,将产物进行测序分析及双酶切后与pEGFP-N2载体连接构建重组质粒pEGFP-N2-PTEN;利用脂质体法将pEGFP-N2-PTEN重组质粒转染至子宫内膜癌细胞HEC-1B中,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在HEC-1B细胞内的表达情况,Western blot法检测PTEN蛋白的表达,转染成功后通过MTT法检测融合蛋白对子宫内膜癌细胞HEC-1B增殖的影响。结果:pMD18-T-PTEN质粒测序与GenBank中人PTEN编码区(CDS)序列(NM-000314.4)一致;pEGFP-N2-PTEN重组质粒经双酶切后用琼脂糖凝胶电泳检测到两个大小分别为1.4kb和4.7kb的片段;外源性野生型PTEN基因在子宫内膜癌HEC-1B细胞中成功表达,蛋白质印迹(Western blot)检测出质粒转染组中PTEN蛋白质高表达;过表达的野生型PTEN能有效抑制HEC-1B细胞的生长(P<0.05)。结论:成功构建了pEGFP-N2-PTEN重组真核表达质粒,经脂质体转染后可在子宫内膜癌HEC-1B细胞中高表达;外源性野生型PTEN对HEC-1B细胞的增殖有抑制作用。
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