烟雾吸入性肺损伤是导致战争和军事演习中减员的主要因素之一，是军事医学的重要研究课题。烟雾吸入后发生的主要病理生理变化是细胞损伤、炎症反应和血液系统高凝状态。其中，上皮/内皮细胞的损伤难以纠正逆转，是烟雾吸入性肺损伤疗效不佳的主要因素。损伤细胞的修复包括再生和纤维化两种进程。因此，寻找一种既可以修复吸入性损伤时受损的支气管/肺组织，又可以控制纤维化进程的治疗方法，就显得极为需要。近年来，具有自我更新和多向分化潜能的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），因取材不受伦理限制、纯化扩增技术较成熟等优势，为治疗烟雾吸入性肺损伤带来了新的希望。　　已有研究显示骨髓间充质干细胞因为其具有分化作用、免疫调节作用和“归巢”作用，对急性肺损伤（acute lung injury，ALI）有一定的治疗作用。其中分化作用最为主要，但是人们对其在烟雾吸入性肺损伤中的作用及干预机制却并不十分了解。关于BMSCs治疗烟雾吸入性肺损伤的相关研究显示：BMSCs可能通过Notch信号通路提高烟雾吸入性肺损伤后的血管再生；BMSCs在烟雾吸入性损伤的小鼠体内最初大量定居于肺部，7.5小时达高峰，24小时后开始向腹腔迁移；沉默非肌肉肌球蛋白ⅡA（non-muscle myosinⅡA，NMⅡA）的BMSCs能够更有效的减轻早期烟雾吸入性损伤。可见在移植初期促使BMSCs向肺泡上皮细胞大量分化，减少纤维化对烟雾吸入性肺损伤的治疗具有重要意义。　　Notch信号通路是影响多能祖细胞的分化、细胞凋亡、细胞增殖及细胞边界的形成的主要通路。研究表明Notch信号通路可以调节肺微血管再生，其化学抑制在Krt5+细胞分化为成熟肺泡细胞中是必需的，在慢性肺病患者肺中识别高度活跃的Notch信号区域可以提示不完全的肺泡修复。所以本实验主要选择Notch通路进行研究，并推测烟雾吸入性肺损伤时调控Notch通路可以调控BMSCs定向分化。　　受国内外研究的启发，本研究拟观察BMSCs移植治疗烟雾吸入性肺损伤的效果，并通过对BMSCs定向分化及调控机制的研究，提高损伤修复的效果，防止纤维化。　　第一部分 烟雾吸入性肺损伤模型的建立　　研究目的：　　建立烟雾吸入性肺损伤模型，并了解不同时间点肺组织损伤程度，为后续实验选择BMSCs移植时机提供参考依据。　　研究方法：　　实验动物随机分为正常组、烟后4h组、烟后24h组和烟3次组四组(n=5)，分别观察各组大鼠临床指标、血气分析，ELISA法对支气管肺泡灌洗液和肺组织中促炎、抑炎因子进行测定，HE染色对肺组织进行肺损伤评分，Western bliotting法对肺组织中凋亡蛋白含量进行测定。　　研究结果：　　1．烟雾吸入后各组大鼠均出现了不同程度的呼吸困难，呼吸频率、PaO2呈下降趋势，PaCO2相应上升，烟3次组各项指标有所好转；　　2．烟雾吸入后各组大鼠支气管肺泡灌洗液和肺组织中促炎因子IL-6、TNF-α含量升高，在烟3次组达最高；抑炎因子IL-10、IL-13含量下降，在烟后24h达最低，烟3次组有所上升，但未达正常水平；　　3．烟雾吸入后各组大鼠肺组织均出现不同程度肺损伤表现，烟后24h组肺损伤评分最高；　　4．烟雾吸入后各组大鼠肺组织中凋亡蛋白Bax和casepase-3含量升高，烟后24h组与烟3次组含量最高，两组间比较无显著差异(P＞0.05)，Bcl-2含量下降，烟3次组含量最低。　　研究结论：　　证明建立烟雾吸入性肺损伤模型的方法可行；通过对烟雾吸入后不同时间点大鼠临床指标、血气分析、支气管肺泡灌洗液和肺组织中炎症因子、肺组织病理学和凋亡蛋白含量变化等指标的测定，认为烟雾吸入后24小时的肺损伤程度最重。　　第二部分 骨髓间充质干细胞在烟雾吸入性肺损伤大鼠的体内示踪及分化作用观察　　研究目的：　　证明BMSCs对烟雾吸入性肺损伤有治疗作用，BMSCs对烟雾吸入性肺损伤的治疗作用是通过分化作用实现的。　　研究方法：　　贴壁法分离、培养BMSCs，对BMSCs进行形态学、表面标记、诱导分化潜能鉴定；转染绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）；24只大鼠随机分为正常组、正常+GFP-BMSCs组、烟雾损伤组和烟雾损伤+GFP-BMSCs组四组，每组6只；尾静脉注射2×106/mlGFP-BMSCs，分别于2h、4h、6h采用活体荧光成像系统体内追踪，6h后处死大鼠；HE染色对肺组织进行肺损伤评分，SA-β-gal法检测细胞衰老，Western blotting法检测肺组织pdpn、SPD浓度，免疫荧光法观察肺组织中AQP5、SPD、CD34、CC10阳性细胞的变化。　　研究结果：　　1．成功培养BMSCs并鉴定，转染GFP；　　2．GFP-BMSCs移植到正常和烟雾吸入损伤大鼠后4h在肺组织中均有归巢，6h仍在损伤肺组织中浓聚；　　3．烟雾损伤+GFP-BMSCs组肺损伤减轻，肺损伤评分下降；　　4．正常+GFP-BMSCs组、烟雾损伤组较正常组衰老细胞均增多，烟损+GFP-BMSCs组衰老细胞数量减少；　　5．正常+GFP-BMSCs组和正常组比较、烟雾损伤+GFP-BMSCs组和烟雾损伤组比较，pdpn、SPD的蛋白含量均增高，正常+GFP-BMSCs组以pdpn升高为主，烟雾损伤+GFP-BMSCs组以SPD升高为主；　　6．烟雾损伤后以AQP5阳性细胞含量减少为主，移植BMSCs后各组均见到了AQP5、SPD、CD34、CC10和GFP-BMSCs的共表达，正常+GFP-BMSCs组以AQP5阳性细胞增高为主，烟雾损伤+GFP-BMSCs组以SPD、CD34阳性细胞增高为主。　　研究结论：　　通过肺病理染色和细胞衰老检测，证明BMSCs对烟雾吸入性肺损伤有治疗作用，通过免疫荧光和western blotting法证明该治疗作用是通过分化作用实现的；BMSCs移植到正常和烟雾吸入损伤大鼠后4h即归巢到肺组织，6h即不同程度向I型肺泡上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞、Clara细胞分化；在正常机体中移植BMSCs主要向ATI分化，在损伤肺组织中BMSCs主要向ATⅡ分化。　　第三部分 烟雾吸入性肺损伤中骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞分化的机制研究　　研究目的：　　通过对Nocth通路相关蛋白表达和含量变化的研究，了解BMSCs移植到烟雾吸入性肺损伤大鼠体内后，Notch信号通路在BMSCs定向分化及肺泡上皮细胞纤维化过程中的作用。　　研究方法：　　实验动物分组同第二部分，Western blotting法检测Notch通路受体Notch1蛋白、效应蛋白α-SMA的浓度，免疫荧光染色法观察Notch1表达。　　研究结果：　　烟雾损伤组较正常组Notch1、α-SMA蛋白含量增高，正常+GFP-BMSCs组Notch1、α-SMA蛋白含量的变化率均高于烟雾损伤+GFP-BMSCs组的变化率，正常+GFP-BMSCs组Notch1表达多于烟雾损伤+GFP-BMSCs组。　　研究结论：　　BMSCs移植到正常大鼠体内通过激活Notch通路促进肺泡上皮细胞向成纤维细胞转化，BMSCs移植到烟雾损伤大鼠体内通过抑制Notch通路减少肺泡上皮细胞向成纤维细胞的转化，防止纤维化。