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exendin-4(肠降糖素类似物)是从一种蜥蜴(Gila monster lizard)的唾液腺毒素中分离出来的由39个氨基酸组成的多肽。它与胰升糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)这种在2型糖尿病中调节血糖的关键物质有53％的氨基酸同源性。exendin-4能够通过激活GLP-1受体诱导胰岛素释放。由于exendin-4不被二肽基肽酶(DDP-IV)降解，其半衰期比GLP-1长，降血糖作用也更强、更稳定。因此，exendin-4是一种有前景的2型糖尿病治疗药物。目前，人工合成多肽成本较高，因此，用DNA重组技术建立一套在大肠杆菌中高效表达及纯化重组exendin-4的方案是本研究努力的方向。在本研究中，我们人工合成了N端带有牛肠激酶位点、C端带有终止密码子的exendin-4基因，并将基因重组到pET-32a(+)载体中，构建成exendin-4与硫氧还蛋白(thioredox)及六聚组氨酸(hexahistidine)的融合表达载体pET-32a(+)-exendin-4，转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL12(DE3)获得表达菌株，经IPTG诱导发酵的菌体超声破碎后，裂解液用Ni离子亲和层析纯化得到融合蛋白。最后经用毕赤酵母系统表达生产的牛肠激酶轻链(bovine-EKL)切割以制备重组exendin-4。结果表明，在30℃用0.1mM浓度的IPTG对筛选到的exendin-4／His融合蛋白工程菌进行8小时诱导表达的效果最佳，得到的目的蛋白约占总蛋白量的16％以上。经检测，最终每升菌液可获得约32mg纯度为88％以上的exendin-4／His融合蛋白。用G418 YPD平板筛选获得了多bovine-EKL基因拷贝的酵母工程菌，在30℃保持以0.5％的甲醇对其进行96小时诱导表达，获得了含较高纯度分泌型bovine-EKL蛋白的酵母上清。后经硫酸铵沉淀和阴离子交换层析，获得纯度近100％的bovine-EKL蛋白。最后经过超滤浓缩得到20mg／L(1.6μg／μl)的终产品。酶切验证实验表明，约1067ng bovine-EKL终产品可切开50μg融合蛋白。随后，应用自制bovine—EKL切割exendin-4／His融合蛋白获得分子量约为4.2kDa的酶解片断，这与exendin-4理论分子量一致。本研究结果表明，运用pET-32a(+)载体能使exendin-4重组蛋白高效表达；运用毕赤酵母系统表达的牛肠激酶轻链具有活性，并能用于切割exendin-4／His融合蛋白从而制备重组exendin-4。本研究初步建立了一种经济高效获得重组exendin-4的方法，为药物研发的进一步研究打下了良好的实验基础。