脑室周围白质软化（periventricularleukomalacia，PVL）为早产儿最为常见的脑损伤，其主要病理特征是少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)前体的受损和丢失，最终导致髓鞘损害和神经纤维不能髓鞘化。未经包裹髓鞘的轴索，其动作电位的传输速度可由430km/h(120m/s)锐减为3.6km/h(1m/s)甚至终止，从而导致严重残疾。迄今对脑白质病变尚无有效防治方法。目前已证实脑内具有内源性的修复功能，在脑内的多个部位存在具有祖细胞样功能的神经祖细胞，其中白质和SVZ区域被认为具有胶质细胞源性的修复潜能，可为脑白质损伤的内源性修复提供OL前体的再生资源。已证实新发现的P2Y样受体-G蛋白偶联受体17(Gproteinreceptor17，GPR17)，可能与脑白质内在修复功能的启动密切相关，作为脑损伤的传感器，可能调控脑白质损伤后的内在修复。阻断小鼠的大脑中动脉后72小时，在白质损伤的边缘区域可出现呈GPR17+/BrdU+神经祖细胞的明显增殖，同时表达成熟OL细胞标志物的OL数量也明显增加。提示随着缺血诱导GPR17的激活，后者可促使白质内静止的OL神经祖细胞出现增殖，并沿其自己的途径分化为成熟OL细胞，也意味着GPR17在脑白质的内源性修复机制中可能具有关键作用。但从目前的研究进展来看，脑的内源性修复作用十分有限，脑缺血或疾病诱导的再生细胞多在数周内死亡。已证实神经再生与相关神经营养因子的调控、以及神经祖细胞实施修复功能的脑微环境密切相关。如何促进脑的内在修复潜能正趋向于成为治疗脑白质病变的重要策略。　　UDP-糖是激活GPR17的内源性协同剂。研究证实，体外应用UDP-糖，可诱导GPR17激活，促进白质GPR17阳性神经祖细胞增殖并分化为成熟OL细胞。胶质细胞源性神经营养因子（glialcelllinederivedneurotrophicfactor，GDNF）是一种与神经细胞存活、生长相关的神经营养细胞因子。本课题组以往研究曾发现GDNF能明显增强外源性神经干细胞的移植疗效。美金胺(Memantine)是一种非竞争性的NMDA受体拮抗剂，可有效改善缺氧缺血所导致的脑内不良微环境，对缺血型脑性损伤具有良好的神经保护作用。本课题组的前期研究结果显示，应用美金胺，能明显改善PVL大鼠的长期预后。　　在国家自然科学基金的资助下，依据脑内具有内源性修复潜能的学说，本学位课题应用Brdu示踪、免疫荧光多标、凋亡检测、光电镜病理，基因沉默，荧光定量PCR及蛋白印迹等技术，拟分别从体内外探讨5日龄PVL新生大鼠未成熟SVZ祖细胞和白质祖细胞这两条路径的内在修复功能、以及GPR17与未成熟脑白质内在修复功能的关联性，并从促进GPR17激活、阻断缺血诱导谷氨酸受体的兴奋毒性以及改善脑白质内在修复微环境等多角度入手，探讨UDP-糖、GDNF和美金胺对脑白质内源性修复功能的促进作用、以及对脑白质损伤功能恢复的远期效果，期望从促进脑内在修复潜能的角度，对难治性早产儿PVL制定有效的防治策略。　　第一部分缺血诱导GPR17在未成熟脑白质的表达部位和表达时相体内外研究　　（一）缺血诱导GPR17在未成熟脑白质的表达部位和表达时相的体外研究　　制备培养3日龄新生大鼠脑白质神经细胞，分为缺氧乏糖(OGD)组和正常对照组，分别于OGD后24h、48h、72h、7d和14d系列测定GPR17的基因表达和蛋白合成;并将GPR17分别与不同神经细胞标志物共标记，从体外确认缺血诱导GPR17在未成熟脑白质的表达部位及表达时相。结果显示，体外缺血可诱导GPR17在胶质源性祖细胞、OL前体、神经元及激活的小胶质细胞内表达，在静止的小胶质细胞和星型胶质细胞中则无表达。同时体外缺血诱导GPR17过表达，可促使胶质源性祖细胞出现增殖和向OL前体分化。　　（二）缺血诱导GPR17在未成熟脑白质的表达部位和表达时相的体内研究　　建立5日龄新生大鼠脑室周围白质软化(PVL)动物模型，于造模后24h、48h、72h、7d和21d系列测定GPR17的基因表达和蛋白合成;并将GPR17分别与不同神经细胞标志物共标记，从体内确认缺血诱导GPR17在未成熟脑白质的表达部位及表达时相。结果显示，体内缺血主要诱导GPR17在胶质源性祖细胞、OL前体、神经元及激活的小胶质细胞内表达，在静止的小胶质细胞和星型胶质细胞中则无表达。同时GPR17过表达可促使胶质源性祖细胞出现增殖、迁移和向OL前体分化。缺血诱导未成熟白质GPR17的过表达可能具有双重作用，在损伤早期主要促进神经元损伤，后期则主要促进白质的重构和修复。　　第二部分GPR17激活启动未成熟脑白质内在修复机制的体内外研究　　（一）GPR17激活启动未成熟脑白质内在修复机制的体外研究　　建立3日龄新生大鼠脑白质神经组细胞OGD模型，通过BrdU示踪、荧光免疫三标以及再生细胞存活率评估，从体外观察缺血诱导GPR17激活启动未成熟脑白质的内在修复情况。结果证实，体外缺血可诱导GPR17过表达，促使胶质源性神经祖细胞激活、增殖和向OL系细胞分化，但其增殖周期仅能维持一周左右，最终仅有极少量新生OL前体能够分化为成熟OL。凋亡检测结果也进一步证实OGD可明显诱导白质新生细胞出现凋亡和坏死。　　（二）GPR17激活启动未成熟脑白质内在修复机制的体内研究　　建立5日龄新生大鼠PVL动物模型，通过BrdU示踪、免疫荧光三标、光电镜技术以及再生细胞成活评估，从体内观察缺血诱导GPR17激活启动未成熟脑白质的内在修复情况。结果证实，PVL组大鼠脑室周围的白质细胞凋亡数明显增加，白质均呈现轻度或重度病变，髓鞘形成数目及其厚度均明显减少和变薄。免疫荧光结果显示，体内缺血可诱导未成熟白质内GPR17过表达，促使胶质源性祖细胞激活、出现明显增殖、向损伤区迁移和向OL系细胞分化，但其增殖周期仅能维持一周左右，最终仅有极少量新生OL前体能够分化为成熟OL。　　第三部分GPR17基因沉默对未成熟脑白质内在修复机制的影响　　将针对GPR17基因设计的3对siRNA分别转染入培养的5日龄新生大鼠白质神经组细胞内，通过检测GPR17基因及其蛋白，选择其中抑制作用最强的一对siRNA转染入培养的白质祖细胞内，通过BrdU追踪、OL系列标志物与GPR17共标记、以及再生细胞成活状况评估，观察GPR17基因沉默对未成熟脑白质内在修复机制的影响。结果证实，GPR17基因沉默可明显抑制未成熟白质胶质源性祖细胞的激活、增殖和分化，加剧缺血诱导未成熟白质新生胶质源性细胞的凋亡和坏死。提示GPR17在未成熟脑白质的内源性修复潜能中具有不可或缺的启动作用，促使白质胶质源性神经祖细胞的激活、增殖和进一步分化，同时GPR17也可能参与了神经细胞局部营养的调控。　　第四部分促进SVZ和白质内在修复潜能的体内外研究　　（一）UDP-糖促进缺血诱导SVZ和白质内在修复潜能的体外研究　　分别建立3日龄内新生大鼠SVZ和脑白质神经组细胞OGD模型，在OGD后即刻加入UDP-糖100μM/L和BrdU100μg/ml共培养，通过BrdU示踪、荧光免疫三标以及再生细胞存活状况评估，从体外观察应用UDP-糖促进SVZ和白质内在修复潜能的效果。结果显示，白质细胞UDP-糖组新生NG2+/GPR17+/BrdU+神经祖细胞、O4+/GPR17+/BrdU+OL前体以及CNPase+/GPR17+/BrdU+不成熟OL和MBP+/GPR17+/BrdU+成熟OL均较OGD组明显增加(p＜0.05或0.01)，SVZ细胞UDP-糖组新生OL前体、不成熟OL和成熟OL亦均较OGD组明显增加(p＜0.05或0.01)。提示体外应用UDP-糖可促进白质祖细胞的明显增殖，并能明显促进SVZ和白质新生祖细胞向OL系细胞分化。凋亡检测结果亦证实UDP-糖组的凋亡和坏死细胞较OGD组明显减少(p＜0.05或0.01)。从体外研究确认UDP-糖可明显促进缺血启动脑内来自SVZ和白质的内源性胶质源性的神经再生功能，并显著提高再生神经细胞的存活率。　　（二）UDP-糖促进缺血诱导SVZ和白质内在修复潜能的体内研究　　对5日龄PVL大鼠在建模后2h经腹腔注射BrdU100mg/kg和UDP-糖2000mg/kg，通过BrdU示踪、荧光免疫三标、Western印迹实验、光电镜病理以及再生细胞成活状况评估，从体内观察应用UDP-糖促进SVZ和白质内在修复潜能的效果。结果显示，白质细胞UDP-糖组新生神经祖细胞、OL前体、不成熟OL和成熟OL、以及SVZ细胞UDP-糖组新生OL前体、不成熟OL和成熟OL均较OGD组明显增加(p＜0.05或0.01)。提示体外应用UDP-糖可促进白质祖细胞的明显增殖，并能明显促进SVZ和白质新生祖细胞向OL系细胞分化。蛋白印迹实验结果显示，UDP-糖组的GPR17合成量在PVL后72h、96h和7d均明显高于同时段Sham组和PVL组(p＜0.05或0.01);TUNEL检测显示UDP-糖组大鼠的脑白质细胞凋亡数明显减少(p＜0.05或0.01);光电镜病理显示脑白质病变明显改善，髓鞘形成数目明显增加，髓鞘厚度与正常大鼠相似。从体内确认UDP-糖能明显促进缺血启动PVL大鼠脑内源自SVZ和白质的内源性修复功能，促进新生OL前体分化成熟，提高再生神经细胞的成活率，并显著改善了PVL大鼠的脑白质病变和促进髓鞘形成。这种改善作用可能与UDP-糖启动了GPR17为枢纽的脑的内在修复潜能并参与新生细胞营养调节相关。　　（三）三药联用促进缺血诱导SVZ和白质内在修复潜能的体外研究　　分别建立3日龄内新生大鼠SVZ和脑白质神经组细胞OGD模型，在OGD后即刻加入UDP-糖100M/L、GDNF100μg/L、美金胺50μm/L和BrdU100μg/ml共培养，通过BrdU示踪、免疫荧光三标以及再生细胞存活状况评估，从体外观察联用UDP-糖、GDNF和美金胺促进SVZ和白质内在修复潜能的效果。结果显示，SVZ和白质细胞三药联用组的新生神经祖细胞、OL前体、不成熟OL和成熟OL均较OGD组明显增加（p＜0.05或0.01）。提示体外联用UDP-糖、GDNF和美金胺可明显促进SVZ和白质祖细胞的增殖和向OL系细胞分化。凋亡检测亦证实三联药组的凋亡和坏死细胞较OGD组明显减少(p＜0.05或0.01)。从体外确认UDP-糖、GDNF和美金胺联用可明显促进缺血诱导脑内来自SVZ和白质的内源性胶质源性神经再生功能，并显著提高再生神经细胞的成活率。　　（四）三药联用促进缺血诱导SVZ和白质内在修复潜能的体内研究　　对5日龄PVL大鼠在建模后2h经腹腔注射BrdU100mg/kg、UDP-糖2000mg/kg、美金胺20mg/kg及经右侧脑室注射GDNF100μg/kg，通过BrdU示踪、荧光免疫三标、光电镜病理以及再生细胞存活状况评估，从体内观察联用UDP-糖、GDNF和美金胺促进SVZ和白质内在修复潜能的效果。结果显示，SVZ和白质细胞三联药组的新生神经祖细胞、OL前体、不成熟OL和成熟OL均较OGD组明显增加(p＜0.05或0.01)。提示体外联用UDP-糖、GDNF和美金胺可明显促进SVZ和白质祖细胞的增殖和向OL系细胞分化。TUNEL检测显示三联药组大鼠的脑白质细胞凋亡数明显减少(p＜0.05或0.01);光电镜病理显示脑白质病变明显改善，髓鞘形成数目明显增加，髓鞘厚度与正常大鼠相似。从体内确认UDP-糖、GDNF和美金胺联用能明显促进缺血启动PVL大鼠脑内源自SVZ和白质的内源性修复功能，促进新生OL前体分化成熟，提高再生神经细胞的成活率，并显著改善了PVL大鼠的脑白质病变和促进髓鞘形成。这种改善作用可能与这些药物能促进脑的内源性胶质源性神经细胞再生以及改善脑微环境密切相关。　　第五部分对单用或联用三药大鼠长期预后的随访评估　　分别对单用或联用UDP-糖、GDNF和美金胺的各组大鼠于26日龄进行随访。通过造模前后每日称重、光电镜病理检查以及水迷宫和斜板测试，综合评估上述促进剂对PVL大鼠长期预后的影响。结果证实，单用或联用UDP-糖、GDNF和美金胺对PVL大鼠体重增长不良，空间学习记忆能力，肌肉运动协调能力，脑白质病变及髓鞘形成不良均有明显的改善效果，明显改善了PVL大鼠的长期预后，尤以三药联用显示出更好的改善趋势。　　第六部分单用和联用三药促进缺血诱导SVZ和白质内在修复潜能的效果比较　　通过对三药联合应用和单独应用的比较，显示UDP-糖、GDNF和美金胺均能明显促进来自SVZ和白质这两条途径的内源性胶质源性的脑白质修复功能，减轻脑白质病变和减少新生细胞的凋亡，并明显改善脑白质损伤大鼠的不良预后，尤以三药联用的改善效果更趋明显。这种改善作用可能与UDP-糖启动了GPR17为枢纽的脑的内在修复潜能及参与新生细胞营养调节、GDNF能促进再生细胞的生长和成活、以及美金胺能阻断缺血诱导OL和髓鞘的兴奋毒损伤、有助于改善脑微环境有关。由此提示缺血性脑白质损伤的病理机制是一个复杂过程，促进脑白质的内源性修复机制应从多方面入手，联合治疗应成为今后治疗早产儿脑白质损伤的努力方向。　　通过上述六大部分的体内外系列研究，证实缺血可诱导GPR17激活，从而启动脑白质的胶质源性内源性修复潜能，但这种内源性的修复作用十分微弱，最终仅有极少量新生OL前体能分化成熟。UDP-糖单用或联用GDNF和美金胺均能明显促进缺血诱导PVL大鼠脑内源自SVZ和白质这两条途径的内源性修复功能，促进新生OL前体分化为成熟OL，提高再生神经细胞的成活率，显著改善PVL大鼠的脑白质病变和促进髓鞘形成，并明显改善了PVL大鼠的远期预后。推测这种良好的改善作用，与其能明显促进脑的内源性胶质源性神经细胞再生以及改善脑微环境密切相关，有望成为今后促进脑白质内源性修复联合应用的有效药物，为难治性早产儿PVL的成功治疗提供了可行性。