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帕金森病(PD)是一种常见的、危害严重的中老年神经变性疾病,其主要病理特征是黑质多巴胺能神经元的变性死亡和残存神经元内路易小体(Lewy body)形成,临床上以肌强直、震颤和运动减少等为主要症状。PD病因及发病机制至今不明。一系列的研究结果表明泛素蛋白酶体(Ubiquitin Preteasome System,UPS)降解途径的异常是导致PD发病的重要机制之一。而泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)是UPS降解途径中的一个重要的功能酶。研究报道,在PD患者甚至阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)患者大脑内都发现有UCH-L1的下调和广泛的氧化修饰,1998年Leroy等报道UCH-L1的193M突变可导致常染色体显性遗传性PD。因而对UCH-L1及其193M突变在PD的发病机制中的研究不仅对探讨遗传性PD而且对散发性PD的致病机制都具有重要意义。
第一部分:抑制UCH-L1去泛素化酶功能对神经母细胞瘤细胞SK-N-SH的毒性作用及机制的探讨
193M突变去泛素化酶的活性与野生型相比下降了约50％左右,故我们推测UCH-L1去泛素化酶功能受损可能会影响细胞的去泛素化过程而导致细胞毒性作用。
1.UCH-L1抑制剂LDN-57444作用于SK-N-SH细胞系抑制UCH-L1去泛素化酶活性；MTT检测细胞活力、Hoechst染色检测细胞核、流式细胞仪(Annexin V-PI)检测凋亡细胞,结果显示该抑制剂对细胞的毒性作用呈剂量依赖性,显微镜下观察细胞形态正常的SK-N-SH细胞贴壁能力强,细胞体积较大,神经突起较明显,加抑制剂24 h后细胞体积变小,突起减少变短,细胞贴壁能力减弱,随着浓度增加细胞明显变小变圆,突起几乎消失,荧光显微镜下可见有明显的核碎裂及凋亡小体。
2.Western Blot检测多聚泛素化蛋白、荧光定量检测LIPS功能:经UCH-L1抑制剂处理后,多聚泛素化蛋白含量明显增加,引起UPS功能受损。
3.Western Blot检测内质网应激相关蛋白Bip/Grp78、XBP-1、CHOP/Gadd153的表达,三者在UCH-L1抑制剂作用后表达均升高,提示内质网应激参与了UCH-L1抑制剂诱导的细胞凋亡。
4.α-synuclein是否通过UPS途径降解还存在争议。UCH-L1抑制剂作用于SK-N-SH细胞并没有影响a-synuclein的水平,提示α-synuclein通过LIPS途径降解的观点还缺乏充足的证据。
结论及意义:UCH-L1的去泛素化酶功能对神经元的存活和正常功能的维持具有重要作用,抑制其去泛素化酶功能,影响了UPS的功能,进而导致多聚泛素化蛋白增加。积聚的多聚泛素化蛋白首先引发未折叠蛋白反应继而进展为内质网超载反应,最终导致细胞凋亡。UCH-L1抑制剂虽然影响了UPS的功能,导致多聚泛素化蛋白增加,但没有影响到α-synuclein的水平,提示α-synuclein通过YPS途径降解的观点还缺乏充足的依据。
第二部分:UCH-L41 I93M突变在PD致病机制中的作用
1.在SH-SY5Y细胞系中过表达UCH-L1野生型及193M突变,用共聚焦显微镜观察两者在细胞内的表达、分布情况,结果显示两者在转染后的SH-SY5Y细胞内均有表达且表达量丰富。UCH-L1野生型呈均匀一致分布,而193M突变分布不均匀,形成聚集体。
2.免疫荧光显示聚集体内除了有UCH-L1(I93M)外,还有a-synuclein成分和骨架蛋白α-tubulin共存,这与路易小体性质相似,且过表达I93M突变体对细胞有毒性作用,提示I93M突变形成的聚集体参与了导致PD机制。
3.用Western Blot及免疫共沉淀方法研究I93M突变形成聚集体的因为。MG132能够阻止UCH-L1的降解,提示UCH-L1是通过UPS途径降解的,而过表达后随着时间的推移细胞内会有UCH-L1(I3M)的堆积,而UCH-L1野生型则没有,表明I93M突变后影响了其降解。免疫共沉淀显示I93M在降解途径中的泛素化进程受到影响。
结论及意义:UCH-L1 I93M突变过表达对细胞是有毒性作用的。产生毒性作用的可能因为在于I93M突变后的UCH-L1的泛素化进程受到影响,不能通过UPS途径正常降解导致其堆积。
第三部分:UCH-L1 I93M突变对微管系统影响的初步研究
1.与野生型UCH-L1相比,过表达UCH-L1 I93M突变后,破坏了细胞内微管系统的正常的网络结构。微管蛋白的染色显示正常的细胞具有复杂清晰的网络骨架,而I93M过表达的细胞内网络骨架紊乱。
2.微管系统是维持神经元突起的必需的结构成分,因而微管系统受到干扰后会导致神经突起的退行性病变。我们的实验结果发现,正常细胞具有长的光滑的突起,而过表达I93M突变尤其形成大量聚集体的细胞内的微管系统网络结构破坏,使得正常的神经突触的形态无法维持,突起末端变钝或者呈现不规则形态。
3.过表达I93M突变形成聚集体和微管系统结构的破坏,加重了内质网的负担,有可能触发错误折叠蛋白反应/内质网应激。我们进一步检测错误折叠蛋白反应触发后的标志性蛋白Bip/Grp78,过表达193M突变的细胞内Bip/Grp78表达量明显升高,提示错误折叠蛋白反应触发。
结论及意义:UCH-L1 I93M突变过表达在细胞内形成聚集体并对细胞产生毒性作用,但是聚集体如何影响细胞功能的内在机制还不明确。本研究在过表达UCH-L1I93M突变的细胞内检测到微管系统的结构紊乱,以及与此相一致的神经元突起的退行性病变和未折叠蛋白反应的触发。通过UCH-L1 I93M对细胞内微管系统影响的研究提示微管系统可能是UCH-L1 I93M突变的一个潜在靶点,对微管系统的影响可能损害了细胞的结构和功能。