研究背景及目的:肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,除了放疗、手术和介入治疗,化疗是也是肝癌治疗的重要手段。但是目前在肝癌的化疗过程中,肝癌常产生严重的耐药和治疗抵抗,因此寻求增强化疗药物敏感性的相关措施具有重要的临床意义。索拉非尼作为FDA批准的首个肝癌分子靶向药物,其有效性和安全性得到广泛认可,对延长患者疾病的进展时间以及生存期具有明显效果。但耐药性也明显影响了索拉非尼的临床治疗效果。因此,如何抑制肝癌耐受索拉非尼,提高其治疗效果,逐渐成为近年来人们关注的热点。自噬相关蛋白4B(Autophagy related 4B,ATG4B)是哺乳类细胞自噬调节的关键蛋白,ATG4B的活性变化与肝癌的发生发展及化疗抵抗密切相关。乙酰化/去乙酰化修饰是蛋白质活性调节的重要方式,但其是否参与调节ATG4B的活性,目前未见相关报道。ATG4B的乙酰化水平变化很可能通过影响ATG4B活性而调节细胞自噬水平。由于保护性自噬水平升高是导致肝癌细胞对索拉非尼耐药的重要机制,因此,探讨ATG4B乙酰化水平、ATG4B活性及自噬水平三者之间的信号调节机制及该机制在肝癌细胞耐受索拉非尼中的意义,并基于此针对性地设计增强索拉非尼对肝癌细胞敏感性的措施,从而为克服索拉非尼的耐药性提供新的策略与依据。索拉非尼的耐药还与肿瘤细胞周围缺氧的微环境密切相关,而二氯乙酸盐(dichloroacetate,DCA)是丙酮酸脱氢酶激酶的抑制剂,是一种重要的抗代谢性药物。研究表明DCA能够较好的抑制肿瘤的恶性增殖并能显著增敏多类化疗药物杀伤肿瘤的效果。由于DCA具有逆转肿瘤细胞糖酵解并改变肿瘤细胞周围的酸性微环境的作用,从而使其成为一种极具吸引力的肿瘤化疗增敏剂。因此,探讨DCA能否增敏索拉非尼及其联用的分子机制,将有助于索拉非尼在肝细胞癌治疗中的临床应用。研究内容及研究方法:第一部分抑制SIRT2-ATG4B(Acetylation)-autophagy通路增敏索拉非尼抗肝癌的效应及机制研究1.通过CCK-8实验,验证索拉非尼对肝癌细胞存活的影响和自噬的诱导作用。2.通过免疫沉淀和免疫沉淀联合质谱的方法,鉴定ATG4B是否存在乙酰化修饰及其可能的修饰位点。3.通过免疫沉淀和CCK-8实验,验证ATG4B的乙酰化修饰在索拉非尼诱导肝癌细胞保护性自噬中的重要性。4.通过免疫沉淀、Western blot、联合去乙酰化酶抑制剂和乙酰化酶抑制剂,筛选介导ATG4B乙酰化的去乙酰化酶或乙酰化酶。5.应用免疫沉淀、Western blot和基因沉默技术,筛选调控ATG4B乙酰化修饰的去乙酰化酶。6.通过免疫沉淀、Western blot和AU4S系统,进一步确认SIRT2对ATG4B乙酰化修饰的调控作用及对ATG4B功能活性的调控。7.使用特异位点突变及Western blot、免疫沉淀、CCK-8实验,鉴定SIRT2介导的ATG4B乙酰化修饰位点及其生物学意义。8.通过基因沉默技术,确定抑制SIRT2对索拉非尼诱导肝癌细胞自噬及增殖抑制的影响。9.通过动物移植瘤实验,确定抑制SIRT2-ATG4B(Acetylation)-autophagy信号轴对索拉非尼抗肝癌的增敏效果。第二部分二氯乙酸盐增敏索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究1.通过CCK-8实验验证DCA对索拉非尼杀伤肝癌细胞的增敏效应。2.通过流式分析和Western blot,探索联合用药对肝癌细胞凋亡的影响。3.通过Wetern blot及基因过表达技术,检测抗凋亡蛋白水平变化对联合用药后肝癌细胞凋亡的影响。4.分别在转录水平与蛋白酶体水平抑制蛋白合成与降解,分析联合用药后对抗凋亡蛋白水平影响的可能机制。5.通过流式细胞术检测联合用药对肝癌细胞中ROS水平的影响。6.抑制ROS后,Western blot检测联合用药对JNK活性的影响。7.抑制ROS/JNK通路后观察联合用药对肝癌细胞凋亡的影响。8.通过Western blot与CCK-8实验,探究联合用药对自噬的影响。9.通过动物移植瘤实验,确定DCA对索拉非尼抗肝癌的增敏效果。研究结果:(一)抑制SIRT2-ATG4B(Acetylation)-autophagy通路增敏索拉非尼抗肝癌的效应及机制研究1.索拉非尼在杀伤肝癌细胞的同时诱导了细胞的保护性自噬反应,这是导致肝癌细胞对索拉非尼抵抗的重要机制。2.ATG4B存在明显的乙酰化修饰现象。3.ATG4B的乙酰化修饰水平和索拉非尼诱导的自噬程度相关。4.SIRT2是调控ATG4B乙酰化修饰的关键去乙酰化酶。5.SIRT2是通过使ATG4B第39、259位的赖氨酸去乙酰化而调控ATG4B的活性和功能进而调控细胞的自噬进程。6.通过敲降SIRT2能够明显增强ATG4B乙酰化修饰水平、使ATG4B活性降低并抑制细胞自噬水平,同时索拉非尼处理,可以降低索拉非尼诱导的保护性自噬,进而增敏索拉非尼的肝癌细胞杀伤效应。7.移植瘤小鼠实验证明,抑制SIRT2-ATG4B(Acetylation)-autophagy信号轴可显著增强索拉非尼的抗肝癌效果。(二)二氯乙酸盐增敏索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究1.DCA可显著增强索拉非尼对肝癌细胞的杀伤效应。2.两药联用能够显著增强肝癌细胞的凋亡率。3.两药联用通过促进Mcl-1和Bcl-2的降解而显著降低其蛋白水平。4.药物联用显著增强了肝癌细胞的ROS水平和JNK的活性。5.两药联用激活的ROS-JNK通路促进了肝癌细胞凋亡。6.药物联用诱导了肝癌细胞的保护性自噬作用。7.移植瘤小鼠实验证明,DCA可显著增强索拉非尼的抗肝癌效果。结论:1.在肝癌细胞中,索拉非尼通过激活SIRT2-ATG4B(Acetylation)-autophagy通路,导致ATG4B的第39、259位赖氨酸乙酰化修饰水平明显降低,ATG4B活性增强,自噬水平升高,进而导致肝癌细胞对索拉非尼治疗的抵抗。靶向SIRT2或者ATG4B的乙酰化修饰均可增敏索拉非尼对肝癌的杀伤作用。2.二氯乙酸盐联合索拉非尼呈现出明显的抗肝癌细胞效应,相关机制与ROS/JNK通路的活化及抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2的水平降低密切相关。二氯乙酸盐联合索拉非尼可明显促进ROS水平的升高和JNK活化,Mcl-1和Bcl-2水平降低,同时Mcl-1的降低也使肝癌细胞的保护性自噬水平增强,加入自噬抑制剂可使肝癌细胞凋亡进一步增加。本实验结果为肝癌的临床用药提供了新的思路和依据。