研究背景基因工程化T细胞过继性免疫治疗肿瘤是目前免疫系统抗肿瘤研究中的热点,主要包括基因工程化T细胞受体(T cell receptor, TCR)和基因工程化嵌合性抗原受体(chimeric angtigen receptor, CAR)两种方法。T细胞识别肿瘤细胞发生免疫反应的过程,是由T细胞表面表达的TCR与肿瘤细胞表面表达的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)提呈的肿瘤相关抗原相(Tumor associated antigen, TAA)结合引发的。TCR基因是由α-和β链组成的,这两条链可以来源于肿瘤特异性的T细胞。比如,将病人的肿瘤细胞与T细胞共培养,从与肿瘤细胞发生反应的T细胞中克隆出TCR基因。α和β链与CD3复合体中的Y-、6-、ε-、<-链相关。当TCR与肿瘤细胞表面MHC复合体提呈的肿瘤相关抗原片段结合后,免疫受体酪氨酸基活化基序发生磷酸化,引起胞内信号传导,导致T细胞释放细胞因子和毒性复合体。TCR基因的优点在于TAA可以从肿瘤细胞中整个蛋白克隆出来,包括胞内部分。所以,无论肿瘤相关抗原发生变异与否,TCR基因工程化T细胞抗肿瘤细胞的反应接近于体内真实的免疫反应反应过程。但是,应用TCR的局限性在于,因为MHC限制的存在,每个TCR基因只能用于一部分病人。因此,为了扩大基因工程化T细胞的适应症,非MHC限制性的基因重组CAR的方法就诞生了。CAR主要由胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区三部分构成。膜外区是一段单链可变区结构域(single chain Fv domain,scFv),具有特异性识别并结合TAA的功能。其构成是将单克隆抗体的重链可变区(the variable region of heavy chain, VH)和轻链可变区(the variable region of light chain, VL)用一可弯曲的多肽接头(Linker)将VH和VL连接起来,构成VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。铰链区通常是由免疫球蛋白超家族组成,比如CD8, CD28和IgG。胞内信号传导区主要是由CD3复合体中的ζ-链组成。近年来,随着研究的深入,人们发现,在胞内区的信号传导区加入共刺激分子如CD28或／和CD137,可以加强T细胞的抗肿瘤免疫反应活性,因此,出现了二代及三代的CAR。表达CAR的T细胞可以直接识别并结合肿瘤细胞表面的TAA, CAR将信号传入T细胞内,激活T细胞分泌细胞因子包括穿孔素、颗粒酶、INF-γ、TNF-α等,从而发挥杀伤肿瘤细胞作用。因此,CAR T细胞是MHC非限制性的。CAR T细胞将抗体-抗原特异性结合能力以及T细胞介导的杀伤功能结合于一体,制作简单,应用广泛,是免疫抗肿瘤治疗的重要方法。嵌合性抗原受体方法应用的关键是确定一种肿瘤相关性抗原,在肿瘤细胞表面高表达,而在正常组织中无表达或者低表达。原癌基因人上皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2, Her-2/neu)又称HER2或C-erbB2基因,在多种肿瘤的发病及临床进程中发挥重要作用,体外与动物实验已明确显示HER2/neu基因扩增、蛋白过度表达在致瘤转化和肿瘤发展中起着关键作用。研究证实：30%以上的人类肿瘤组织中,如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌、唾液腺癌、舌癌、头颈部鳞癌、非小细胞性肺癌等,均伴有Her2/neu基因的扩增及p185蛋白的过度表达,而正常组织中p185蛋白为阴性或微量表达。而在乳腺癌中,大约有1/3的病人过表达HER2蛋白。过表达HER2蛋白使肿瘤的侵袭性更强,是乳腺癌病人预后不良的独立的危险因素。尽管抗HER2单克隆抗体如曲妥株单抗在临床的应用使部分病人获益,但是其价格昂贵,很大程度上限制了其大规模临床应用。HER2蛋白位于细胞表面,容易被抗体识别,因此,HER2蛋白可作为表达嵌合性抗原受体T细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。中国科学技术大学免疫学研究所刘兢教授课题组采用表面表位包埋法(surfaceepitope masking method, SEM)生产的人源化单克隆抗体A21是一种新型的抗ErbB2抗体,它具有很强的结合特异性和抑瘤活性；可特异性识别HER2胞外区C-端的第Ⅰ结构域,远离HER2受体二聚化功能位；而帕妥珠单抗及曲妥珠单抗分别识别第Ⅱ及第Ⅳ子域。因此,chA21是不同于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的新型的抗HER2的单克隆抗体,可以无空间限制性的识别p185蛋白的同源二聚体。以这种新型的抗HER2的抗体为基础的CAR T细胞过继性免疫治疗肿瘤目前尚无人研究。本研究中的人源化的抗HER2的ch A21scFv由中国科技大学刘兢教授惠赠。目的本研究旨在以ch A21scFv为基础构建靶向HER2的第二代(chA21scFv-28ζ)嵌合性抗原受体,利用慢病毒载体将嵌合性抗原受体基因转染至T淋巴细胞；观察表达嵌合性抗原受体的T淋巴细胞的生物学特点；评价表达嵌合性抗原受体的T淋巴细胞体外的抗肿瘤的作用。方法1.重叠PCR法构建靶向HER2的嵌合性抗原受体chA21scFv-28ζ,并制备成慢病毒颗粒。2.利用流式细胞仪技术检测肿瘤细胞表面HER2抗原的表达。3.利用慢病毒载体将嵌合性抗原受体chA21scFv-28ζ基因转导至T淋巴细胞,利用流式细胞仪技术检测T淋巴细胞表面嵌合性抗原受体的表达效率以及生物学特点。4.检测表达嵌合性抗原受体的T淋巴细胞在体外抗HER2+肿瘤功能：ELISA法检测细胞因子释放,51Cr释放实验检测CART细胞杀伤肿瘤细胞的能力。结果1.成功构建了靶向HER2的嵌合性抗原受体chA21scFv-28ζ并进行测序。2.流式细胞仪分析表明人乳腺癌细胞SKBR3、T47D、MCF-7、MDA-MB-231和卵巢癌细胞株SKOV3, OVCAR3, A2780和A1847都不同程度的表达HER2,其中SKBR3、SKOV3为高表达,其他细胞株为中表达或者低表达。人乳腺癌细胞株MDA-MB-468为HER2阴性的肿瘤细胞株,小鼠肺癌细胞株TC-1也不表达人HER2抗原。3.靶向HER2的嵌合性抗原受体chA21scFv-28ζ基因通过慢病毒载体成功转入T淋巴细胞并高表达,培养扩增后约75%的淋巴细胞为CD8+T淋巴细胞,并大部分(约80%)呈中央记忆型(CD45RO+CD62L+)。4.表达靶向HER2的chA21scFv-28ζ嵌合性抗原受体的T细胞在体外能够特异性识别HER2(+)的肿瘤细胞,并大量释放细胞因子IFN-γ和IL-2。表达靶向HER2的chA21scFv-28ζ嵌合性抗原受体的T细胞能够杀伤并裂解HER2(+)的乳腺癌及卵巢癌细胞系,但不能裂解HER2(-)的肿瘤细胞系。结论1.chA21scFv-28ζ CAR设计成功,并能制备成慢病毒颗粒；2. chA21scFv-28ζ CAR可以成功转染T细胞并在T细胞内稳定的表达；3. chA21scFv-28ζ CAR转染T细胞分化为中央记忆型,并能大量增殖,其中绝大多数为CD8+T细胞；4.chA21scFv-28ζ CAR T细胞可以高效裂解HER2阳性的肿瘤细胞并分泌大量的细胞因子INF-γ和IL-2。研究背景尽管一代的CAR T细胞在实体瘤中基本上没有取得明显的临床效果,但是以二代及三代CAR为基础的T细胞过继免疫抗肿瘤治疗已在多种肿瘤的临床实验中显示成效,在血液系统肿瘤中有更明显的优势。Pule等对8例晚期神经母细胞瘤患者中应用CAR T细胞治疗,4例病人的肿瘤出现了坏死,其中1例病人获得完全缓解。Kochenderfer等对4例晚期淋巴瘤患者进行CART细胞治疗,3例病人获得部分缓解。美国宾夕法尼亚大学的Carl June教授研究组利用CAR T细胞治疗3例慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者,发现CAR T细胞可以在体内扩增1000倍以上,维持有效抗肿瘤活性、清除CLL细胞达6个月以上。部分CAR T细胞甚至可以以记忆细胞形式存在,在病人体内再次接触CLL细胞时产生快速反应。其中,2例患者治疗后病情达到完全缓解。该研究结果刊登于《Sci Transl Med))和《N Engl JMed》上。因此,CAR T细胞过继免疫抗肿瘤治疗具有十分广阔的临床应用前景,而Maus在等更是把CART细胞形容成血液系统肿瘤中的“第一把交椅”。CART细胞在实体肿瘤中的重要性也被大家所认识,针对多种肿瘤相关抗原的临床实验也在进行当中。前期HER2特异性的CART细胞主要是是曲妥珠单抗为基础,并已经在许多的肿瘤模型中取得成功,包括乳腺癌,卵巢癌,髓母细胞瘤,胶质母细胞瘤和骨肉瘤。本研究中所采用的chA21为新的抗HER2的单克隆抗体,它与HER2蛋白的结合位点不同于曲妥珠单抗及帕妥珠单抗。我们已经从体外实验发现,chA21scFv-28ζCAR可以成功转染T细胞并在体外高效裂解HER2阳性的肿瘤细胞,所以,以chA21为基础的HER2特异性的chA21scFv-28ζ CAR T细胞的抗肿瘤效果值得进一步研究。目的本研究旨在观察表达chA21scFv-28ζ CAR T淋巴细胞在HER2+R乳腺癌小鼠肿瘤模型中的作用特点,评价chA21scFv-28ζ CAR T淋巴细胞对HER2+乳腺癌肿瘤生长的影响。方法1.利用NOD-SCID小鼠和HER2+乳腺癌细胞株SKBR3来构建小鼠乳腺癌肿瘤模型。2.小鼠成瘤后,利用尾静脉注射的方法向小鼠体内注射2x107chA21scFv-28ζ CART淋巴细胞,每周一次,共2周。以未转染的激活T细胞作为对照。3.游标卡尺记录小鼠肿瘤体积的变化。4.小鼠肿瘤体积达到2mm3时,处死小鼠,获取小鼠肿瘤组织,称重,并免疫组化法检测肿瘤组织内人CD3+T淋巴细胞。结果1.成功构建HER2+小鼠乳腺癌SKBR3肿瘤模型。2.小鼠体内注射未转染T细胞及chA21scFv-28ζ CAR T淋巴细胞后小鼠位出现腹泻、体重下降、皮疹等不良反应。治疗组小鼠肿瘤体积逐渐缩小,对照组小鼠肿瘤组织生长迅速。3.免疫组化结果显示,治疗组小鼠肿瘤组织内可以检测到大量CD3+的人T淋巴细胞,对照组只检测到少许CD3+的人T淋巴细胞。结论1. chA21scFv-28ζCART细胞可以有效抑制HER2阳性乳腺癌肿瘤在NOD-SCID小鼠体内的生长。2. chA21scFv-28ζ CAR T细胞通过定位于HER2阳性的肿瘤组织内发挥抗肿瘤作用。