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猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的高度接触性传染病。该病严重危害养猪业的发展,APP弱毒疫苗具有能够重复提呈抗原和持续性刺激免疫应答的优点,对APP基因缺失弱毒疫苗研究是本病疫苗研究的重要方向。本实验深入进行了对已经构建的三株APP基因缺失株的生物学特性和免疫原性研究,研究内容和结果如下：1、APP不同基因缺失株生物学特性的研究以APP血清7型基因缺失株apxIIC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+.和APP血清5型的基因缺失株SW1△ⅠC为研究对象,进行其不同基因缺失株的生物学特性测定。NAD依赖性测定：将基因缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC单菌落接种到10mL的TSB+NAD培养基中,37℃,300 r/min培养18h,同时设TSB培养基为对照组。结果显示三株基因缺失株在TSB+NAD培养基中生长良好,在不含NAD的TSB培养基中不生长。结果表明三株基因缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/IN+和SWl△ⅠC在体外生长均具有NAD依赖性。生长特性测定：将基因缺失株SW1△ⅠC.apxIIC-/kan+、apxⅡC-/IN+单菌落接种到TSB+NAD培养基中震荡培养10 h,第二天将上述菌液以1：1000的稀释度接种于新的TSB+NAD培养基中,每小时测定其OD600值,并绘制生长曲线,同时设亲本株APP-5和APP-7为对照组。试验结果为亲本株APP-5和缺失株SW1△ⅠC的生长曲线差异不显著；亲本株APP-7和缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+的生长曲线差异不显著。结果表明缺失株与其亲本株的生长特性无明显差异,进一步揭示apxⅠC基因或apxⅡC基因的缺失不影响亲本株APP-5或APP-7的生长。溶血性试验测定：在兔血平板上测定apxⅡC-/kan+、apxIIC-/ⅠN+和SW1△ⅠC的溶血活性,设APP-5.APP-7为阳性对照,DH5α为阴性对照。结果显示在血平板上,APP三株基因缺失株均无溶血环产生,而APP-5菌株和APP-7菌株均有明显溶血环产生,试验表明APP三株基因缺失株apxIIC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC均失去了溶血活性,进一步揭示APP缺失apxⅠC或apxⅡC基因后,能明显降低其溶血活性。细胞毒性试验测定：将基因缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△IC的上清液接到恒河猴胚胎肾细胞(MA-104),24 h后在倒置显微镜下观察其细胞形态,设TSB培养基为对照组。结果显示接种缺失株SW1△ⅠC菌液上清细胞形态正常,无明显细胞病变；接种缺失株apxⅡC-/kan+和apxⅡC-/ⅠN+菌液上清的细胞有少量的死亡,有较轻细胞病变。结果表明缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC上清液对细胞毒性均减弱,且SW1△ⅠC减弱最为明显。小鼠毒力试验测定：将缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC腹腔接种小鼠,记录小鼠3天后的死亡情况,计算LD50的值,设APP-5型菌株、APP-7型菌株为对照。试验结果为与APP-7相比,缺失株apxⅡC-/kan+的毒力降低了约5倍,缺失株apxⅡC-/ⅠN+的毒力降低了约7倍；与亲本株APP-5相比,缺失株SW1△ⅠC的毒力降低了约15倍。结果表明三株缺失株的毒力降低明显,进一步揭示毒素apxⅠ比毒素apxⅡ毒力强。2、APP不同基因缺失株小鼠的免疫效力试验将缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC分别免疫6周龄雌鼠,共免疫三次,每次免疫间隔两周。于免疫前、一免两周、二免两周和三免两周断尾采血并分别检测毒素ApxI和ApxⅡ的ELISA抗体水平。结果显示,缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC均能够产生较高的毒素抗体。TSB对照组的小鼠在整个试验过程中血清抗体均呈阴性。三免两周后,分别用10LD50和20LD50APP血清1、5、7型菌攻毒。缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC均对APP血清1、5、7型菌(10LD50)攻毒的小鼠保护率为100%；缺失株apxⅡC-/kan+对血清1、5型菌(20LD50)攻毒保护率均为25%,对血清7型菌(20LD50)攻毒保护率为62.5%；缺失株apxⅡC-/ⅠN+对血清1、5、7型菌(20LD50)攻毒保护率均为50%；SW1△ⅠC对血清1型菌(20LD50)攻毒保护率为37.5%,对血清5型菌(20LD50)攻毒保护率为100%,对血清7型菌(20LD50)攻毒保护率为50%。小鼠免疫试验结果初步显示,缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC对同源血清型和异源血清型菌均有保护效力,且SW1△ⅠC缺失株对小鼠的保护力优于apxⅡC-/kan+和apxⅡC-/ⅠN+缺失株。