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CD8+T(CTLs)细胞在机体免疫防御中起着重要作用。然而,慢性病毒感染和肿瘤表面多为广泛存在的自身抗原,因此在患者体内针对这些细胞的高亲和力CTLs在阴性选择时就已经被克隆清除,而保留下来的低亲和力的CTLs往往表现为克隆无能。同种反应是指T细胞识别同种细胞表面的抗原肽/MHC复合物(pMHC),进而产生应答,在临床上表现为同种异体移植排斥反应。其中,移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)发生时往往伴随有移植物抗白血病反应(graft-versus-leukemia reaction,GVLR)而抑制白血病的复发。而且已有资料显示同种T细胞(参与同种反应的T细胞)具有pMHC特异性。因此,给慢性病毒感染和肿瘤患者过继pMHC特异性的同种CTLs有望绕过耐受,特异性清除病患。然而,大量研究结果显示诱导肿瘤或病毒特异性同种CTLs,却很难避免一些非特异性CTLs产生。换言之,难以制备单一pMHC特异性的同种CTLs。为此,本课题设计了一个新策略:我们将装载了其限制性肽的MHCⅠ类分子结合到MHC型别不同的巨噬细胞上,使巨噬细胞能够“呈递”该同种表位给自身/同系淋巴细胞,从而诱导单一pMHC特异性的同种CTLs。一、制备H-2Kd/IgG2aFc分子,该分子能有效结合到C3H小鼠巨噬细胞表面通过融合小鼠H-2Kd胞外段和IgG2aFc段制备二价的肽/H-2Kd/IgG2aFc分子。其IgG2aFc段可与C3H小鼠巨噬细胞(H-2Kk)表面的FcγRⅠ结合,使巨噬细胞能够“呈递”同种表位(特异性肽/H-2Kd),从而诱导自身/同系淋巴细胞产生单一pMHC特异性的同种CTLs。首先从BALB/c小鼠脾细胞(H-2Kd)和HB-95细胞株(表达IgG2a)中分别克隆了H-2Kd胞外段和IgG2aFc段的cDNA,再经重组PCR得到H-2Kd/IgG2aFc融合基因,插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,形成重组质粒pcDNA3.1(+)-[H-2Kd/IgG2aFc]。电转染到J558L细胞中,获得稳定表达的克隆株Kd-Fc-J558L。培养上清经葡萄球菌蛋白A(SPA)柱纯化得到融合蛋白。Western-blotting、ELISA及流式细胞术检测结果证实该融合蛋白由二聚化的H-2Kd的胞外段和IgG2aFc段组成,命名为H-2Kd二聚体;装载了其限制性肽(GAD546-554或S199-208)的二聚体称为GAD/H-2Kd二聚体或HBV/H-2Kd二聚体。C3H小鼠巨噬细胞与GAD/H-2Kd二聚体或HBV/H-2Kd二聚体孵育后,流式细胞术检测到H-2Kk的巨噬细胞表面有H-2Kd分子,表明该巨噬细胞能够“呈递”单一的同种表位,被命名为GAD-巨噬细胞或HBV-巨噬细胞。二、C3H小鼠淋巴细胞与自身GAD-巨噬细胞或HBV-巨噬细胞共培养诱导单一pMHC特异性的同种CTLs为诱导单一pMHC特异性的同种CTLs,我们建立了一个共培养体系:刺激细胞为GAD-巨噬细胞或HBV-巨噬细胞;效应细胞为自身淋巴细胞(C3H小鼠,H-2Kk)。经过6天的共培养,用CFSE稀释法通过流式细胞术检测到共培养体系中的CD8+T细胞在10:1和20:1刺激比例下都有明显增殖。为了进一步了解所诱导CTLs的特性,我们对其进行特异性四聚体染色和细胞毒效应检测。CD8+T细胞经过14天的共培养其特异性四聚体染色频率显著高于非特异性四聚体染色频率,表明所诱导的同种CTLs具有单一pMHC特异性;同时,这种CTLs对含有相应表位(pMHC)的靶细胞有明显杀伤作用,而对含有无关表位的靶细胞杀伤率很低,显然,共培养所诱导的同种CTLs不仅具有单一pMHC特异性,而且是有杀伤功能的。三、C3H小鼠经尾静脉注射同系GAD-巨噬细胞或HBV-巨噬细胞诱导单一pMHC特异性的同种CTLs为了在小鼠体内诱导单一pMHC特异性的同种CTLs,我们用同样的刺激细胞(GAD-巨噬细胞或HBV-巨噬细胞)通过尾静脉注射方式免疫C3H小鼠。经过3次免疫,所诱导CTLs的特异性四聚体染色结果以及细胞毒效应均与共培养一致。体内实验再次证实我们所诱导的同种CTLs具有单一pMHC特异性,而且是有杀伤功能的。该方法为制备肿瘤或病毒特异性的同种CTLs提供策略,所制备的同种CTLs可望用于肿瘤和慢性病毒感染性疾病的过继免疫治疗。