目的:溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种慢性非特异性炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease,IBD）,主要发病部位在大肠,显示出复发和缓解的病程。它是一个复杂并且令人担忧的公共健康问题。其发病率和流行率在世界范围内不断上升。更糟糕的是,大约有15%的UC患者对免疫抑制剂和生物制剂不应答,必须接受结肠切除术。然而,UC的发病机制尚不清楚。UC的发病与多种致病因素有关,如免疫功能失调、遗传易感性、上皮屏障缺陷和环境因素等。其中,失调的免疫应答在UC的发生和发展中起着关键作用,包括外周血液白细胞（特别是单核细胞）的活化增加,单核细胞/巨噬细胞浸润到结肠粘膜,促炎因子如TNF-α,白细胞介素6（IL-6）和IL-1β的表达增加。此外,在结肠炎症的数学模型中,已经证实巨噬细胞是介入治疗的重要靶点。尽管没有特异性,但是大多数用于治疗UC的药物确实可以影响单核/巨噬细胞的活化。这些数据提示单核/巨噬细胞在UC的发病过程中起着重要的免疫调节作用,是治疗UC的重要靶点。CD30配体（CD30L,CD153,基因名:TNFSF8）是一种膜相关糖蛋白,属于肿瘤坏死因子超家族（Tumor necrosis factor superfamily,TNFSF）成员。CD30L主要表达于活化的T细胞、单核细胞/巨噬细胞、B细胞和树突状细胞（DC）。本项目组以往工作中利用Cd30l或Cd30基因敲除小鼠,探讨了CD30L和CD30在肠黏膜适应性免疫细胞上的表达以及对小鼠炎症性肠病肠道炎症发生和发展的影响。证明了CD30L/CD30信号在小鼠IBD肠道炎症性病变形成机制中发挥重要的促炎作用。然而,CD30L在固有免疫细胞介导的IBD中作用机制的研究却鲜有报道。因此,为了深入探讨CD30L对固有免疫细胞,主要是单核/巨噬细胞的作用,进而影响IBD的发生发展。本研究收集了溃疡性结肠炎患者外周血液标本,探讨外周血液单个核细胞中CD30L的表达以及功能,以及CD30L阳性单核细胞亚群与UC疾病的关系,并利用Cd30l基因敲除小鼠建立肠炎模型,研究Cd30l基因缺失后单核细胞对小鼠肠炎发生、发展的影响。为今后进一步深入探讨CD30L在单核细胞促进IBD的发生、发展中的作用机制提供可参考的理论依据。研究方法:1.溃疡性结肠炎患者1.1选取确诊的溃疡性结肠炎患者35例,诊断依据为:临床症状、化验、结肠镜以及病理,并排除其他系统疾病。所有溃疡性结肠炎患者均处于活动期。疾病活动程度评分根据Rutgeerts[1]等人的Mayo评分,分为轻度（3到5分）,中度（6到10分）以及重度（11到12分）。性别以及年龄匹配的健康息肉人群35例作为对照组。1.2外周血液单个核细胞分离:选取溃疡性结肠炎患者以及对照组外周血液,EDTA抗凝处理后,应用淋巴细胞分离液提取外周血液单个核细胞。1.3应用GEO数据库,分析溃疡性结肠炎患者和正常对照组结肠以及外周血液单个核细胞中TNFSF8的表达情况。1.4利用Western Blotting技术检测溃疡性结肠炎患者以及对照组外周血液标本单个核细胞中CD30L蛋白的表达变化。1.5利用流式细胞技术检测溃疡性结肠炎患者以及对照组CD30L+单核细胞、T淋巴细胞分别占总单核细胞以及T淋巴细胞的百分比以及CD30L+单核细胞的数量。1.6利用Real time-q PCR技术检测溃疡性结肠炎患者以及对照组外周血液标本分选出的单核细胞中促炎因子TNFA、IL1B和IFNG,相关趋化因子CCL2,以及血管内皮生长因子VEGFA,相关抑炎因子IL10和ARG1的mRNA表达变化。应用ELISA技术检测溃疡性结肠炎以及对照组中单核细胞分泌的促炎因子TNF-α、IL-1β的血浆水平。1.7利用流式细胞技术检测溃疡性结肠炎患者以及对照组,CD30L阳性经典单核细胞,中间体单核细胞以及非经典单核细胞的百分比以及CD30L阳性经典单核细胞的数量。1.8利用相关性分析统计CD30L阳性经典单核细胞百分比与Mayo score的关系。2.动物模型2.1建立C57BL/6J小鼠CONTROL以及DSS动物模型:动态比较观测小鼠DSS肠炎形成过程中体重、DAI、肠管长度的变化情况,同时利用HE染色技术检测小鼠肠道组织的病理学变化,以及利用小鼠内窥镜检测CONTROL以及小鼠诱导DSS肠炎后,肠道黏膜的破损情况。2.2利用流式细胞技术检测小鼠外周血液中,肠炎诱导后发生的改变:经典单核细胞以及非经典单核细胞百分比以及细胞数目变化;在经典单核细胞和非经典单核细胞中,CD30L阳性百分比和MFI变化;并检测在经典单核细胞中,趋化因子受体CCR2阳性百分比和MFI变化;CD30L+CCR2+经典单核细胞百分比,CCR2在CD30L+经典单核细胞中MFI的变化。2.3利用流式细胞技术检测小鼠肠黏膜固有层内,CONTROL以及DSS动物模型中促炎症性单核细胞百分比以及细胞数量变化;并检测促炎症性单核细胞中CD30L、趋化因子受体CCR2百分比、细胞数和MFI变化,并检测CD30L+CCR2+促炎症性单核细胞百分比和数目变化;以及在CD30L+促炎症性单核细胞中CCR2的MFI变化。2.4利用WT、Cd30l-/-小鼠建立DSS动物模型:动态比较观测Cd30l基因缺失对小鼠肠炎形成过程中体重、DAI、肠管长度的变化情况,同时利用HE染色技术检测小鼠肠道组织的病理学变化,以及利用小鼠内窥镜检测WT以及Cd30l-/-小鼠诱导DSS肠炎后,肠道黏膜的破损情况。2.5利用流式细胞技术检测WT和Cd30l-/-小鼠DSS肠炎形成过程中,外周血液内经典单核细胞和非经典单核细胞百分比以及细胞数目变化;并检测趋化因子受体CCR2在经典单核细胞中,肠炎诱导后百分比和MFI表达变化情况。2.6利用流式细胞技术检测WT和Cd30l-/-小鼠DSS肠炎形成中在肠黏膜固有层内,促炎症性单核细胞百分比和细胞数目变化,以及趋化因子受体CCR2在促炎症性单核细胞中百分比、数目以及MFI表达变化情况。2.7利用流式细胞分选技术,分选出肠黏膜固有层内促炎症性单核细胞,并通过Real time-q PCR技术检测WT和Cd30l-/-小鼠趋化因子Ccl2和其受体Ccr2,促炎性细胞因子Ifng、Tnfa、Il1b以及Il6等的mRNA表达变化,并利用ELISA检测小鼠分选出的肠道促炎症性单核细胞经体外培养,WT和Cd30l-/-小鼠上清中促炎症性单核细胞分泌的效应性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β以及IL-6等的血浆水平变化。结果:1.溃疡性结肠炎患者1.1通过2个GEO数据库分析得出,与正常对照组降结肠,乙状结肠和外周血液单个核细胞相比,溃疡性结肠炎患者降结肠、乙状结肠炎症位点以及外周血液单个核细胞中TNFSF8表达水平显著增加。为了进一步证实这一结论,我们提取溃疡性结肠炎患者以及对照组外周血液PBMCs,得出与对照组相比,溃疡性结肠炎患者PBMCs中CD30L表达水平异常升高,提示CD30L可能在溃疡性结肠炎患者病变形成中发挥潜在的重要作用。1.2提取溃疡性结肠炎患者以及对照组PBMCs,溃疡性结肠炎患者单核细胞中CD30L百分比以及数量明显增加,而在T淋巴细胞中CD30L的百分比在两组中无明显变化。提示CD30L的表达在溃疡性结肠炎患者单核细胞中的重要性。1.3分选溃疡性结肠炎患者以及对照组外周血液单个核细胞,发现与对照组相比,溃疡性结肠炎患者相关促炎因子TNFA、IL1B和IFNG,趋化因子CCL2,以及血管内皮生长因子VEGFA的mRNA表达均显著增加,而相关抑炎因子IL10和ARG1的mRNA表达未见变化。溃疡性结肠炎患者血浆中,促炎因子TNF-α以及IL-1β表达升高。提示溃疡性结肠炎患者中单核细胞中的主要亚群显示出促炎特性。1.4提取溃疡性结肠炎患者以及对照组PBMCs,通过流式细胞术得出:与对照组相比,CD30L阳性的经典单核细胞百分比以及数量明显增加。我们进一步探讨了CD30L阳性经典单核细胞与溃疡性结肠炎疾病严重程度相关性,我们发现Mayo评分和溃疡性结肠炎患者经典单核细胞中CD30L的百分比呈正相关。提示CD30L阳性经典单核细胞百分比与溃疡性结肠炎疾病严重程度呈正相关。通过以上结果,我们得出溃疡性结肠炎患者外周血液促炎的经典单核细胞高表达CD30L,为了探讨CD30L阳性经典单核细胞在IBD中的重要作用,我们利用Cd30l基因敲除小鼠诱导IBD模型,来进行进一步深入研究。2.动物模型2.1首先,我们利用WT小鼠建立DSS肠炎模型。与正常对照组相比,WT小鼠诱导DSS肠炎后体重下降率明显上升、DAI评分上升,结肠长度下降,病理组织学显示DSS肠炎小鼠肠黏膜杯状细胞弥漫性丢失、更严重的黏膜溃疡、隐窝结构紊乱、黏膜下水肿、上皮增生和免疫细胞（如多形核白细胞或浆细胞）在固有层/黏膜下浸润,内镜下显示出DSS肠炎小鼠结肠壁增粗,血管形态迂曲,出现纤维素以及黏膜表面颗粒,以及血便的存在。证明小鼠IBD模型成功建立。2.2提取小鼠外周血液,得出与正常对照组相比,诱导DSS肠炎后,外周血液中经典单核细胞百分比以及细胞数目明显上升;经典单核细胞中CD30L表达明显上调,提示CD30L可能对外周血液中经典单核细胞在DSS病变形成中发挥潜在重要作用。我们也发现,经典单核细胞中CCR2表达上调,尤其在CD30L阳性经典单核细胞中CCR2表达明显上调。提示CD30L可能对经典单核细胞上CCR2的表达以及诱导经典单核细胞向炎症性肠道组织内的归巢起到促进作用。2.3研究小鼠肠道组织,得出:与正常对照组相比,诱导DSS肠炎后,肠黏膜固有层内促炎症性单核细胞中CD30L表达增加,表明炎症情况下,CD30L对外周血液中经典单核细胞向肠道促炎症性单核细胞的分化过程发挥促进作用;我们还发现,促炎症性单核细胞中CCR2表达上调,尤其在CD30L阳性促炎症性单核细胞中,CCR2表达更加显著。提示在DSS病变形成中,CD30L对外周血液中经典单核细胞在CCR2作用下向肠黏膜归巢过程发挥推进作用。2.4敲除小鼠Cd30l基因,发现:Cd30l-/-与WT小鼠诱导DSS肠炎相比,其体重下降率下降,DAI评分下降,肠管长度明显增加,组织病理学分析显示WT小鼠肠黏膜更严重的杯状细胞弥漫性丢失、黏膜溃疡、隐窝结构紊乱、黏膜下水肿、上皮增生和免疫细胞（如多形核白细胞或浆细胞）在固有层/黏膜下浸润显著增加,内镜下显示出WT小鼠结肠壁增粗增加,血管形态更加迂曲,出现更多的纤维素以及黏膜表面颗粒,伴有较多量血便的存在。结果证明,Cd30l基因缺失导致小鼠对DSS肠炎易感性显著下降,耐受性增强,暗示CD30L在DSS肠炎形成中发挥重要促进炎症作用。2.5 Cd30l基因缺失,导致外周血液经典单核细胞百分比以及细胞数目均明显下降。且在经典单核细胞中,CCR2表达亦明显下降。我们进一步探讨Cd30l基因缺失对外周血液经典单核细胞分化的肠道促炎症性单核细胞的改变,我们发现:Cd30l基因缺失后,肠黏膜固有层内促炎症性单核细胞百分比以及细胞数量均显著下降,且促炎症性单核细胞上CCR2表达亦明显下降。再次提示在DSS病变形成中,Cd30l基因缺失会抑制外周血液中经典单核细胞向肠道促炎症性单核细胞分化,也会减少经典单核细胞上CCR2表达,进而减弱经典单核细胞向肠道内炎症组织的归巢。2.6最后我们分选IBD小鼠肠组织内促炎症性单核细胞,发现Cd30l基因缺失导致促炎症性单核细胞中,促炎因子Ifng、Tnfa、Il1b、Il6的mRNA基因表达水平均明显下调,趋化因子Ccl2以及其受体Ccr2的mRNA基因表达水平亦明显下调。我们又把分选出的IBD小鼠促炎症性单核细胞进行体外培养,检测上清中炎症因子表达变化,结果得出Cd30l基因缺失后,促炎因子表达水平均下降。暗示Cd30l基因缺失,通过减少促炎症性单核细胞分泌促炎因子,减轻单核细胞对小鼠促炎作用,进而减轻肠炎病变形成;CD30L可能依赖CCL2-CCR2轴,促进循环免疫经典单核细胞向肠道募集。结论:1.溃疡性结肠炎患者,循环CD30L阳性经典单核细胞显著增加,并且与溃疡性结肠炎疾病严重程度呈正相关。2.Cd30l基因可以促进外周血液中经典单核细胞向肠道促炎症性单核细胞分化,进而上调促炎症性单核细胞促炎因子分泌,提高小鼠对DSS肠炎敏感性,在炎症病变形成中发挥促炎作用。3.Cd30l基因可以促进外周血液中经典单核细胞肠道归巢受体CCR2表达,进而促进其向肠道炎症组织归巢,从而参与肠道内炎症病变形成,推动IBDs的发生、发展。