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目的:恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升,对人体健康造成严重威胁。肽基脯氨酰顺反异构酶1(Pin1)可特异性识别并结合pSer/Thr-Pro位点,并催化含该位点蛋白的顺反异构化,调节蛋白活性、稳定性、蛋白-蛋白相互作用及亚细胞定位等,其在许多肿瘤细胞及组织中过表达,如前列腺癌、食管鳞癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等。Pin1激活50余种致癌基因或促增殖因子,抑制20余种抑癌基因或抗增殖因子,可同时调节多条癌症驱动通路,在肿瘤进展中发挥关键作用,与肿瘤的临床分期及预后密切相关;Pin1也可作为肿瘤的生物标志物及预后指标,是当前的研究热点与方向。近年来,许多Pin1小分子抑制剂都是通过高通量筛选及基于机制和结构的合理设计开发出来的,在酶水平上达到低微摩尔级或低纳摩尔级,但由于其细胞渗透性差,在细胞水平上活性偏低等因素限制其进一步的研究和开发。因此,寻找高效且细胞渗透性好的Pin1小分子抑制剂是十分迫切的。本课题拟通过计算机辅助虚拟筛选、细胞水平活性评价等获得靶向抑制Pin1的高效、高细胞渗透性的化合物,同时考察了该化合物的体外抗肿瘤细胞增殖活性,并初步探讨其作用机制。方法:本课题通过:(1)采用Western blot确定Pin1高表达的肿瘤细胞株,用于后续实验。(2)计算机辅助虚拟筛选和细胞水平活性评价得到先导化合物,以该化合物结构为基础进行优化得到一系列衍生物,通过近一步的细胞水平筛选得到了显著抑制Pin1活性的小分子抑制剂1 169。(3)通过瞬时转染确定有效的Pin1干扰质粒,利用该质粒构建Pin1沉默的稳定转染细胞株。(4)通过热迁移、Co-IP,以及检测化合物1169处理的shPin1稳转株中Pin1及其下游蛋白的表达情况,从而确定化合物1 169在细胞水平对Pin1的靶向活性。(5)在PC3、KYSE70细胞株及shPin1稳转细胞株中,进行MTT、集落形成、transwell等实验并检测迁移相关蛋白的表达,评价化合物1169对细胞增殖、集落形成、迁移的影响及其对Pin1的靶向抑制作用。(6)流式细胞术确定化合物1169对PC3、KYSE70细胞周期的影响。(7)Western blot法检测化合物1169对Pin1下游蛋白表达的影响,初步探讨化合物1169在PC3、KYSE70细胞中的作用机制。(8)通过灌胃给予小鼠高剂量的化合物1169,2周后取心、肝、脾、肺、肾等重要脏器,进行组织蜡块包埋、切片及HE染色,初步确定化合物1169对小鼠的毒副作用。结果:(1)在1 1种肿瘤细胞和2种正常细胞中,Pin1在前列腺癌细胞PC3、食管癌细胞KYSE70中的表达水平较高,且明显高于正常细胞。(2)基于Pin1晶体结构,通过计算机辅助虚拟筛选获得30个化合物,检测其在细胞水平对Pin1下游蛋白CyclinD1表达的影响,获得显著抑制Pin1活性的先导化合物12。(3)在Pin1高表达的前列腺癌细胞PC3和食管癌细胞KYSE70中,与其他衍生物相比,化合物1 169显著抑制Pin1下游蛋白CyclinD1、β-catenin、NFκB、AKT的表达,故获得显著抑制Pin1活性的化合物1 169。(4)获得有效的Pin1干扰质粒shPin1-835,并成功构建Pin1沉默的PC3、KYSE70稳定转染细胞株。(5)在PC3和KYSE70细胞中,CETSA结果表明,化合物1169在细胞水平与Pin1结合,增加了 Pin1的热稳定性;Co-IP结果表明,化合物1169显著抑制Pin1与CyclinD1之间的结合;用化合物1169处理shPin1稳转株后,shPin1组与shPin1+1169组中Pin1下游蛋白表达无显著性差异,表明化合物1169靶向Pin1。以上结果共同表明,化合物1169在PC3、KYSE70细胞中靶向抑制Pin1。(6)在Pin1高表达的PC3、KYSE70细胞中,化合物1169对细胞增殖、集落形成、迁移的抑制作用与Pin1沉默的结果一致,表明化合物1 169通过靶向Pin1显著抑制细胞增殖、集落形成和迁移。(7)细胞周期结果显示,随着化合物1169作用浓度的提高,PC3细胞中G0/G1期比例分别为 63.71%、71.22%、76.73%、83.02%(P<0.01),KYSE70 细胞中 G2/M 期比例分别为 12.28%、14.12%、14.54%、23.73%(P<0.01)。表明化合物1169明显引起PC3细胞发生G0/G1期阻滞,引起KYSE70细胞发生G2/M期阻滞,且具有细胞特异性。(8)化合物1169显著下调PC3、KYSE70细胞中Pin1下游蛋白CyclinD1、β-catenin、NFκB、和AKT的表达,表明该化合物可能通过抑制Pin1活性降低了 Pin1下游蛋白CyclinD1、β-catenin、NFκB、和AKT的稳定性及表达水平,从而发挥抗肿瘤作用。(9)2g/kg化合物1169未引起小鼠死亡,不影响小鼠的正常生长,对小鼠重要脏器无也无明显损伤,故化合物1169体内应用具有较好的安全性。结论:本课题通过计算机辅助虚拟筛选及细胞水平活性评价,在Pin1高表达的PC3和KYSE70细胞中筛选得到靶向抑制Pin1且细胞渗透性较好的化合物1169。化合物1169显著抑制细胞增殖、集落形成和迁移,引起细胞周期阻滞并浓度依赖性地抑制Pin1下游蛋白的表达。化合物1169的抗肿瘤作用机制与其抑制Pin1活性而降低Pin1下游蛋白CyclinD1、β-catenin、NFκB、和AKT的稳定性及表达水平有关。同时,化合物1169在体内具有较好的安全性,可用于接下来的结构优化和体内活性评价研究。