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家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目的模式昆虫,也是重要的经济昆虫。在漫长的进化过程中,家蚕和其它鳞翅目昆虫一样形成了一套独特的先天免疫系统,包括体液免疫和细胞免疫。其中体液免疫主要包括各种识别受体、胞内信号因子、抗菌肽、蛋白酶以及酶级联反应等。由于没有后天免疫系统,家蚕主要通过先天免疫系统克服外界不良环境的影响以及抵抗外源微生物的侵染,如何提高家蚕对外界病原微生物的免疫力一直是蚕业研究领域的热点和难点。在哺乳动物中的研究结果表明,纳米粒子（Nanoparticles,NPs）能通过改变免疫细胞活性、非特异性提高或降低免疫反应,进而参与免疫调节以及激活相关补体系统这三种方式影响机体的先天免疫系统,但是纳米粒子是否会影响家蚕的先天免疫系统还未有研究报道。已有研究表明纳米二氧化钛（Titanium dioxide nanoparticles,TiO2 NPs）具有抗菌功能,不仅抗菌效果持久,而且抗菌谱广。锐钛矿型TiO2 NPs对大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、芽杆菌（Bud bacillus）、曲霉（Aspergillus）以及沙门氏菌（Salmonella）等均具有很强的杀灭效果;低剂量（5 mg/L）的TiO2 NPs,可以促进家蚕的生长,提高家蚕的饲料效率,提高蚕丝产量和质量,还可以提高家蚕对有机磷农药及家蚕核型多角体病（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）的抵抗性,但尚未进一步研究其对家蚕先天免疫系统的影响。因此,本研究采用5 mg/L的TiO2NPs预处理家蚕,以家蚕黑胸败血病和BmNPV为感染源,在分子水平和蛋白水平研究了TiO2 NPs对家蚕先天免疫系统的影响,获得了以下研究结果:1.TiO2 NPs处理后家蚕中肠数字基因表达谱分析为了获得TiO2 NPs预处理后的基因表达谱,本研究对五龄第3天家蚕中肠组织进行了数据基因表达谱（Digital gene expression profile,DGE）检测。结果表明,TiO2NPs预处理后,1 105个基因发生了4.00倍以上的显著差异,上调基因526个,下调基因579个,其中42个基因涉及15条通路的调节发生了显著差异（p<0.05）,其中涉及酪氨酸代谢（tyrosinemetabolism）的5个基因最高上调了12739.00倍,最低的上调了33.47倍,涉及黑色素合成（melanogenesis）的4个基因最高上调了1148.00倍,最低上调了33.47倍。根据基因的go（geneontology）注释和kegg（kyotoencyclopediaofgenesandgenomes）通路分析,差异表达的基因主要参与了免疫应答（immuneresponse）,防御反应（defenseresponse）,能量代谢（energymetabolism）和凋亡（apoptosis）等代谢通路。免疫应答中编码map激酶-erk激酶的基因转录水平上调了65.80倍,防御反应中编码moricini,肽聚糖识别蛋白s6和β-1,3-葡聚糖结合蛋白前体的基因转录水平分别上调了97.68倍,2.68倍和2.16倍,凋亡调控中编码负向调控凋亡蛋白gf12231的基因转录水平上调了48.84倍。结果表明,TiO2NPs处理能促进家蚕先天免疫系统中的酪氨酸代谢、黑色素形成以及抗菌肽moricini的表达,抑制家蚕细胞凋亡的发生,为研究TiO2NPs对家蚕先天免疫系统的影响以及将TiO2NPs应用于蚕病防治提供了有力的数据支撑。2.体外条件下TiO2NPs对家蚕黑胸败血菌的抑制效果为了探讨在体外条件下TiO2NPs对家蚕黑胸败血菌（bacillusbombyseptieus,bb）的作用效果,本研究测定了家蚕黑胸败血菌与浓度分别为0mg/l,5mg/l,50mg/l和100mg/lTiO2NPs孵育后的生长曲线,结果表明TiO2NPs能抑制黑胸败血菌的增殖,且具有剂量效应,TiO2NPs浓度越高,抑制作用越显著。此外,TiO2NPs与黑胸败血菌作用不同时间后的毒力检测,结果表明TiO2NPs对黑胸败血菌的抑制作用具有时间效应,作用时间越长,抑制效果越明显;即TiO2NPs能抑制黑胸败血菌的增殖,且呈现了剂量效应和时间效应。3.TiO2NPs处理对家蚕酚氧化酶活性影响和黑胸败血病的抑制效果dge数据分析可知TiO2NPs能促进家蚕的酪氨酸代谢和黑色素形成,本研究进一步对血淋巴中酚氧化酶活力进行了检测,结果显示,TiO2NPs处理能将ppo酶原活力提高10.43%。qrt-pcr检测了酚氧化酶级联关键基因mapk-erk,pgrp-s2和bmppo1,toll免疫通路关键基因βgrp3,pgrp-s2和rel,imd免疫通路关键基因βgrp4,pgrp-s3和imd以及抗菌肽moricini的基因转录水平,发现TiO2NPs预处理组与水处理组相比均呈现了不同程度上调,最高上调了525.43倍,最低上调2.00倍。通过注射感染黑胸败血菌,发现TiO2NPs预处理组家蚕的存活率提高了13.30%;qrt-pcr结果显示,TiO2NPs降低了家蚕黑胸败血菌引起的酚氧化酶级联、toll和imd通路活化水平。rt-pcr检测bmcaspase3基因转录水平发现TiO2NPs不仅抑制了家蚕自身细胞凋亡的发生,且能抑制家蚕黑胸败血菌感染引起的细胞凋亡。这些结果表明,TiO2NPs通过促进家蚕先天免疫系统中的酚氧化酶级联、toll和imd通路的活化水平和上调抗菌肽moricini的表达的途径增强家蚕对黑胸败血病的免疫,此外,它还能抑制家蚕细胞凋亡的发生。4.TiO2NPs提高家蚕对bmNPv的抗性机制本研究通过添食家蚕TiO2NPs,研究其对bmNPv抗性的影响,分析了bmNPv在家蚕中肠内的增殖特征以及家蚕抗bmNPv和免疫调节相关基因的转录差异。结果表明,低剂量的TiO2NPs添食家蚕,可以提高家蚕对bmNPv的抗性,实验组和对照组144h的死亡率分别是0.56%和8.33%,TiO2NPs预处理显著降低了死亡率。bmNPv在中肠内的增殖特征分析表明,实验组和对照组在感染bmNPv后72h开始明显增殖,对照组在120h达到最高峰,实验组在144h才达到最高峰,高峰值相差12.63倍,表明家蚕添食TiO2NPs可以抑制bmNPv在中肠内增殖,中肠中受bmNPv诱导的家蚕抗bmNPv基因bmlipase-1的转录特征也和bmNPv的增殖规律一致。免疫信号通路分析表明,添食TiO2NPs抑制家蚕体内bmNPv的增殖进而可以降低jak/stat和pi3k-akt的激活水平,但可以促进基因bmakt的表达,提高家蚕自身的免疫力。这些结果表明,TiO2NPs提高家蚕对bmNPv的抗性的机制是通过抑制bmNPv在家蚕体内的增殖以及提高自身免疫来实现的。5.TiO2NPs对家蚕bmn细胞的影响本研究以家蚕卵巢细胞（bmn）为研究对象,检测了浓度为1.25mg/l,2.5mg/l,5mg/l,10mg/l,50mg/l和100mg/l的TiO2NPs处理对bmn细胞增殖的影响,结果发现,TiO2NPs能促进bmn细胞的增殖,且呈现了剂量效应,在100mg/l浓度范围内,TiO2NPs浓度越高,促进作用越明显。此外,本研究还检测了5mg/lTiO2NPs对bmn细胞活性氧（reactiveoxygenspecies,ros）水平的影响,结果发现TiO2NPs能显著降低bmn细胞的ros水平。本课题研究了TiO2NPs对家蚕先天免疫调节机制的影响,获取了TiO2NPs处理后家蚕五龄第3天中肠组织的基因表达谱,阐明了TiO2NPs通过促进家蚕的酚氧化酶级联、toll和imd通路的活化水平以及上调抗菌肽moricini表达的途径增强家蚕对黑胸败血病的抗性,通过抑制BmNPV在家蚕体内的增殖以及提高自身免疫的途径增强家蚕对BmNPV的抗性。本研究阐明了TiO2 NPs对家蚕先天免疫机制的影响,为TiO2 NPs应用于蚕病防治提供了新思路和理论依据。